引用本文:
張琪, 李健, 沈琳. 如何解讀NGS報告——一例進行兩次NGS檢測的肝內膽管細胞癌病案分享[J]. 腫瘤綜合治療電子雜誌, 2019, 5(4): 72-78.
如何解讀NGS報告——一例進行兩次NGS檢測的肝內膽管細胞癌病案分享
張琪，李健，沈琳（北京大學腫瘤醫院 消化腫瘤內科 惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142）
【摘要】 二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術的發展和臨床應用推動了腫瘤領域精準治療前進，腫瘤突變負荷、微衛星狀態、可靶向基因對腫瘤治療預測和預後都發揮著重要作用。作為一種新的臨床檢測手段，各平臺檢測尚缺乏統一的標準，除儘快完善檢測標準外，也要求臨床腫瘤醫生提高對NGS報告的解讀能力。本文報道了一例進行兩次NGS檢測的肝內膽管細胞癌病例，從臨床醫生和測序平臺角度解讀兩份報告，旨在探索臨床腫瘤醫生如何更好利用NGS檢測、解讀NGS報告。
【關鍵詞】 二代測序；基因檢測；肝內膽管細胞癌
肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，IHCC）是發病率僅次於肝細胞癌的原發性肝臟惡性腫瘤[1]，由於其早期診斷率低、惡性程度高，接近70%患者在診斷時已為不可切除或遠處轉移，即使根治性切除術後的患者複發率也極高[2]，術後輔助化療的方案和獲益目前仍存在爭議[3,4]。AJCC分期Ⅲ期患者5年生存率僅為10%，Ⅳ期幾乎為0%[5, 6]。近年來，隨著精準治療的推動，靶向藥物在肺癌、結直腸癌、黑色素瘤等多個瘤種得到充分應用，並提高了生存期；此外，免疫治療也在各個瘤種中“大放光彩”。而針對化療藥物不敏感的肝內膽管細胞癌，靶向治療和免疫治療是有望改善其預後的全身治療方式。
腫瘤領域精準治療的推動得益於二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術的發展，包括目標靶向測序（targeted-regions sequencing，TRS）、全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WES）、全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS），短時間、低成本、高通量的優勢使其與臨床不斷深入結合。但NGS作為一種新的臨床檢測手段，相較傳統檢測技術，其複雜程度大大提高，影響結果的不確定因素顯著增多，實驗操作和生物信息學分析方面不同平臺及產品的標準不同導致在數據解讀上面臨許多挑戰。臨床醫生如何能準確、充分地利用好這把利劍，是一個亟需解決的問題。因此，筆者報道了一例在全身治療前分別送檢兩家公司進行NGS檢測的肝內膽管細胞癌患者，並從臨床醫生和測序公司角度解讀兩份報告，旨在探索腫瘤臨床醫生如何更好地利用NGS檢測、解讀NGS報告。
1 病例簡介
患者男，56歲，體檢時超聲發現肝佔位。既往乙肝病毒感染20年，經干擾素治療後HBsAg轉陰。體格檢查未見異常。癌胚抗原、甲胎蛋白等腫瘤標誌物無異常。上腹部MRI示：肝S4/8段一類圓形腫塊（圖1紅色箭頭），下腔靜脈旁淋巴結增大（圖1紅色圓圈部分）；進一步查PET/CT示：肝右葉多發低密度灶伴代謝增高，下腔靜脈旁淋巴結增大未見代謝，餘肺、消化道等部位未見惡性佔位。患者於2018年11月26日外院行肝S4、5、8聯合部分大網膜切除＋肝門淋巴結清掃術。術後病理顯示腫物為肝內膽管低分化癌，清掃12、13組淋巴結無轉移，無神經侵犯，切緣乾淨，分期：pT3N0M0（AJCC分期Ⅲ期）；免疫組化示：PD-L1腫瘤細胞＋（＞25%），HER2（＋＋）（FISH提示HER2/CSP＝1.24），pMMR。術後1周複查上腹部增強CT：肝切除術後，肝切緣旁可見片狀低密度灶，多發索條影。後患者就診本科，結合患者局部分期較晚，PD-L1表達較高，經患者同意後，予帕博利珠單抗（200 mg q21d）、奧沙利鉑和替吉奧（奧沙利鉑 100 mg/m2 d1＋替吉奧 60 mg bid d1～14，q21d）聯合化療2週期，後帕博利珠單抗單藥治療。
患者就診本科時已分別送檢兩家公司（以下代稱為A和B公司）進行NGS檢測，送檢標本分別為新鮮手術組織塊＋全血（A公司）和石蠟包埋組織（B公司），採用的技術分別為WES（A公司）和TRS（B公司），送檢情況和結果見表1。
2 NGS討論
如前文所述，IHCC惡性程度高，對化療不敏感，預後差，AJCC分期Ⅲ期患者5年生存率僅為10%[5,6]。NCCN指南推薦根據切除狀態選擇以氟尿嘧啶或吉西他濱為基礎的輔助化療聯合或不聯合放療的方案尚未得到Ⅲ期臨床數據的證實[7]；卡培他濱對比觀察組對膽道腫瘤根治術後的研究中，雖然卡培他濱組中位總生存期有升高的趨勢（51個月∶36個月），但在意向治療人群分析中，其差異並未達到統計學意義[8]，並且該研究結果目前尚未發佈。而目前臨床應用較多的吉西他濱聯合順鉑的方案也來自於晚期膽管癌研究[9]，並無輔助治療人群相關研究證實。根據KEYNOTE028研究中期結果顯示，24例PD-L1陽性的進展期膽道細胞癌患者使用帕博利珠單抗，其中4例患者達到部分緩解，4例患者處於疾病穩定狀態，提示免疫治療是IHCC治療的潛在手段[10]。但目前抗PD-1/PD-L1單藥有效率僅為10%～20%[11]。因而，筆者寄希望於NGS檢測結果能提供靶向治療的建議，增加治療有效率。據文獻報道，KRAS和TP53是較為常見的IHCC體細胞突變基因，發生率分別在9%～24%和3%～44%[12]，同其他消化道腫瘤一樣提示不良的預後[13,14]。另約5%的IHCC患者存在BRAF突變，已有研究證實達菲替尼聯合透明質酸酶對BRAF突變的IHCC患者治療有效[15,16]。EGFR突變的發生率相對較低，約0%～7.4%，但厄洛替尼被證實可以提高包括IHCC在內的膽管癌中位無疾病生存期[17]。IDH1/2作為常見的IHCC突變基因，發生率約10%～28%[18]，IDH1抑制劑AG120在一個含IHCC的實體瘤Ⅰ期臨床研究（NCT020273994）初期得到70%（7/10）的有效率[19]，另一個Ⅲ期的研究也正在進行中（NCT02989857）；而IDH2抑制劑AG-221也在一個Ⅰ期臨床試驗中顯示不錯的前景。EGFR基因的突變和融合在IHCC中較為常見，針對EGFR1/2擴增和EGFR3突變的BGJ398在Ⅰ期臨床試驗中顯示出不錯的安全抗腫瘤活性[20]，Ⅱ期研究也得到不錯的初步結果[21]；同時，針對選擇性EGFR抑制劑，如INCB54828（Incyte，NCT02924376），在包括IHCC在內的進展期實體瘤等正在早期臨床試驗階段。此外，有研究顯示ROS1融合突變在IHCC發生率為8.7%（2/23）[22]，克唑替尼等藥物對IHCC患者是否有效需要進一步臨床驗證。
但患者並無上述或其他可靶向的基因位點出現，並且先後送檢兩次NGS檢測結果除微衛星狀態一致，TMB及檢測出突變基因位點完全不同。為此，筆者將病例提請到本院消化內科NGS討論會，邀請包括送檢公司在內的多家測序公司進行討論。
2.1 臨床醫生解讀
2.1.1 A公司標本為取樣3天后的新鮮組織標本，進行包含2.7萬個基因的全外顯子組測序，送檢標本腫瘤組織≥20%。微衛星狀態為MSS。腫瘤突變負荷（tumor mutational burben，TMB）為183個（7.69 Muts/Mb），根據該公司中國腫瘤患者數據庫，各癌腫TMB以三分位數為界值，其中膽管癌界值為125，故認為本例樣本屬於高TMB，可從免疫治療中獲益，但該公司數據庫中膽管癌患者數量不詳，該界值對免疫治療預測的敏感性暫不明確。此外，該樣本檢測到4個基因突變，均被認為是功能未明的驅動基因，並在報告的附件資料中對上述基因致病機制和相關文獻進行具體描述。
2.1.2 B公司標本為取樣10天后的石蠟包埋組織，進行324個基因的目標靶向測序，其中包含34個基因的內含子區域，1個基因啟動子區域和1個非編碼RNA。標本腫瘤組織比例不詳（報告未說明）。報告顯示微衛星狀態為MSS，TMB為0 Muts/Mb。同時，本次檢測也發現了4個臨床意義未明的突變，但具體突變丰度和目前4個基因相關研究進展未做進一步說明。而在後續該平臺進一步提供的數據和相關進展中，值得注意的是此報告中的BRAC突變，目前針對BRAC基因突變的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly ADP Ribose Polymerase，PARP）抑制劑奧拉帕利，已經FDA批准作用於卵巢癌、乳腺癌等多個瘤種。但BRCA2 H523R突變僅是一個意義不明的變異，通過ClinVar網站檢索發現81.8%（9/11）的平臺檢測結果認為該突變是良性（1/11）或可能是良性（8/11），因此該患者對奧拉帕利治療獲益的可能性較小。同時BRAC突變和CDH1突變為和遺傳可能相關的基因，B公司基於對無遺傳信息解讀資質的考慮，報告中不區分突變是體細胞變異還是胚系變異。
就TMB而言， B公司作為FDA首批泛瘤種伴隨診斷NGS產品，採用自主研發的算法，通過全面基因組測序分析計算TMB，被證實和全外顯子測序TMB檢測高度一致[23]。在採用該計算方法的研究中，有來自1456個肝單管細胞癌樣本檢測，中位TMB為2.5 Muts/Mb，大於20 Muts/Mb的僅有1.9%[23]，該患者計算所得TMB為0 Muts/Mb。該算法的一致性數據在ESMO大會上已經多次公佈且被FDA批准，但是東西方人群在不同瘤種中的Cut-off值是否一致，還需要中國臨床數據驗證。A公司檢測到183個突變（7.69 Muts/Mb），根據該公司的數據庫，患者TMB高於數據庫中膽管癌TMB上三分位數，這與B公司所得結果相差較大，但根據該份報告附件顯示，其TMB數值的校正和換算正是對照了B公司發表的算法[23]。此外，兩平臺各自檢出的4個基因突變完全不同，是存在檢測錯誤或胚系突變過濾亦或是腫瘤異質性導致，我們無從得知。雖然就目前而言，上述突變均為臨床意義未明突變，且已檢測出PD-L1陽性的免疫獲益提示尚不會對治療方案的制定造成影響，但對兩份報告出現差異的原因進行進一步探討依然很有價值。
2.2 A公司解讀 該樣本採用包含2.7萬外顯子的WES檢測，測序深度為200 X。進行WGS技術平行比較不同測序深度下腫瘤-對照樣本成對的突變數量和類型之間準確性關係的研究，結果提示：當測序深度為30 X時，可檢測絕大部分的突變；達到50 X的測序深度，檢測到的突變數量和類型發生顯著性差異；但當測序深度達到100 X時，可檢測95%的突變，差異無統計學意義[24]。過分強調測序深度，還可能帶來因測序產生的假陽性結果，增加測序錯誤的風險。並且本產品在進行全外顯子測序前，也使用了測序深度更深的窗口（panel）進行驗證，確保其準確性。
TMB最初即是通過WES和WGS對腫瘤基因組中編碼區發生的非同義突變的數量進行定量而得，目前通過WES統計腫瘤組織非同義突變基因數量，預測可能產生的新抗原的數量是TMB檢測的金標準[25]。市場上所有Panel所檢測的TMB，主要通過與WES的TMB進行校準、建立一定的算法預測TMB值，但各Panel包含基因數目不同、數據庫樣本量差異大、所收集的數據來源於不同種族人群和癌種，各算法間相互獨立，無法比較哪個算法更加準確。此外，隨著各數據庫樣本量增加，TMB預測算法會發生偏移。A公司數據庫目前收錄了中國人群3000多例的腫瘤患者WES數據，根據不同瘤種TMB數據進行統計分析後，得到中國人群的各瘤種TMB閾值分佈，如膽管細胞癌，在A公司數據庫TMB參考閾值為125個突變（人類所有的兩萬多個基因中），為上三分位值為125，超過人群66.6%，即當膽管細胞癌患者體內發生突變基因數量超過125時，提示該患者可從免疫治療中獲益。
本產品對人類基因組上的9500個微衛星位點進行檢測，基於Niu等[26]建立的MSI算法，對MSI結果進行判斷。檢測結果＜1%時，為MSS；檢測結果1%～3.5%時，為MSI-Low；檢測結果＞3.5%時，為MSI-High。該患者檢測結果為0%，因此為MSS。
關於突變位點的檢測，雖然通過測序深度高的Panel進行檢測，尤其是對於突變頻率較低的突變檢測，準確性高[27]，但目前關於低頻突變與臨床治療療效之間的關係仍無定論。而WES可提供完整的臨床相關基因突變譜。對腫瘤-對照樣本對進行WES檢測，可以瞭解患者的全部遺傳信息，但目前明確與遺傳性腫瘤相關的基因突變只有40個左右。本著遵循隱私保護、知情同意和保護患者利益等倫理原則，在開展基因檢測前，我們會仔細詢問患者是否有腫瘤家族史，經患者知情並同意後，公司才會出具遺傳報告，否則存在披露患者遺傳信息的嫌疑。該患者並無腫瘤家族史，本次對患者白細胞進行檢測後，發現的都是臨床意義未明突變的胚系突變，與遺傳腫瘤無明確關係，所以本份報告未描述。
除基因突變檢測外，我們還進行了染色體拷貝數變異（copy number variations，CNVs）檢測。所有腫瘤都可能會發生染色體數量或結構改變，即體細胞拷貝數變異（somatic copy number alterations，SCNA。作為導致腫瘤發生的重要因素之一，SCNA易導致瘤內異質性，促進腫瘤增殖，使腫瘤產生高度的侵襲性，並有耐藥性和預後差的特點。有研究顯示，SCNA與腫瘤增殖和免疫逃逸相關[28]。目前，SCNA的臨床應用包括SCNA抑制和SCNA誘導兩個方向：前者通過抑制細胞週期，如CDKi和APCi，抑制染色體不穩定（chromosomalinstability，CIN）陽性腫瘤細胞中導致染色體異常分離或結構改變等異常的過程，以減緩或阻止SCNA發生，達到治療目的；後者主要通過誘導產生更多的CIN，如Paclitaxel、AURKAi等，導致細胞凋亡。但SCNA與免疫細胞浸潤和免疫檢測點抑制劑之間的關係尚未明確[29]。與單核苷酸變異相比，CNV更具備提示預後的意義，拷貝數異質性高於中位數的非小細胞肺癌患者無疾病生存期更差，無論分期、疾病再發或死亡的風險都會增加[30]。該樣本檢測到Chr.17q擴增和Chr.14q缺失，屬於染色體臂變異。根據腫瘤發生的階段劃分，該患者應該屬於染色體臂變異驅動腫瘤的發生，促進免疫逃逸，但暫無證據患者可以從上述治療中獲益。
2.3 B公司解讀 該樣本採用NGS大panel檢測，平均測序深度＞500 X。TMB計算採用自主研發算法，計算每兆鹼基中體細胞突變的數目，即TMB＝次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）大於等於5%的體細胞突變個數/靶向基因組大小。算法包含所有編碼區單點置換和短片段缺失突變，同時包含同義突變和非同義突變，且根據遺傳多態性公共數據庫及公司內部數據庫過濾了胚系突變。該樣本檢測出4個MAF≥5%的突變（均為VUS突變），但經過算法預測，4個突變均為胚系突變，不納入TMB計算，因此符合計算TMB的突變個數為0，即TMB為0 Muts/Mb。雖然WES是檢測TMB的金標準，但對檢測使用的平臺要求也較高，只有經過系統性能驗證的WES平臺才能保證檢測結果的準確性。本平臺TMB算法與經過系統性性能驗證的WES計算的TMB高度一致，且具有高準確性、精確性、可再現性和可重複性。在2018年ESMO上公佈的最新分析驗證數據表明，本平臺計算的TMB與WES平臺計算的TMB一致性達到86%，可重複性和可再現性分別達到97.3%和95.3%。
本報告不用於預測腫瘤的遺傳易感性（如結直腸癌遺傳易感基因APC）或者基於胚系突變的用藥指導（如BRCA1/2的胚系突變），因此未做體細胞突變和胚系突變的描述——平臺利用自主研發的算法可預測胚系突變，經驗證該算法預測準確性≥95%[31]，但從產品定位的角度考慮，檢測報告不區分胚系/體系突變。
進行微衛星狀態評估時，我們選取了95個讀長為10～20 bp的微衛星位點，以最大化的涵蓋樣本間差異。10～20 bp的微衛星位點可以確保涵蓋在NGS的讀長內，也可以確保高比例DNA聚合酶的結合及滑動。該算法與傳統PCR檢測和免疫組化的方法比較，一致性達到97%，特異性達到95%[32]。
此外，本報告檢出的4個基因變異均是臨床意義未明的變異，其MAF分別為50.92%、48.64%、48.67%、50.21%。如前所述，本產品不區分體細胞變異和胚系變異，經實驗室算法預測4個變異均為胚系變異。A公司檢測出了4個基因變異，MAF分別為11.40%、6.19%、6.80%、7.59%。本產品覆蓋該4個基因，報告未檢出該4個基因存在變異, 該4個變異經本平臺實驗室核實確實不存在。針對該4個變異兩家平臺檢測結果完全不同，A公司WES檢出的該4個基因變異MAF不高，不排除假陽性的可能。可用第三方平臺（比如數字PCR）做進一步驗證。
3 總結
對於一份NGS報告，臨床醫生在核實患者基本信息和標本來源（組織標本或外周血標本）後，首先應關注樣本質量的把控，包括採樣時間、標本類型（新鮮組織標本、石蠟包埋組織、細胞學標本、全血）、腫瘤細胞比例。一般情況下，用於NGS檢測的組織標本中腫瘤細胞核比例建議至少達到20%。由於存在石蠟包埋組織DNA/RNA降解的可能性，新鮮組織標本無疑是為最理想的，但由於實際條件限制，多數送檢的仍是石蠟包埋組織，也有平臺表明其對石蠟包埋組織標本檢測也能達到極高的準確度[33]。
MSI-H/dMMR、TMB是較為明確的免疫治療療效預測指標[34-36]。目前PCR仍是檢測MSI的“金標準”，但對組織樣本量的要求、檢測時長、檢測費用等因素限制了其在臨床的廣泛使用，而NGS對MSI的檢測逐漸得到大家的認可[37-39]，但具體檢測位點，各平臺並無統一標準。根據TMB的定義（即腫瘤樣本全基因組去除胚系DNA變異後體細胞突變數目），全外顯子組測序應是最為準確的檢測方法，但近年來也有一些研究證實了檢測數百個基因的panel通過一些計算也能得到和WES檢測一樣準確的結果[23,40,41]。介於WES的價格原因，多數平臺採用後者進行檢測計算，但對TMB的算法和界值也並沒有統一的標準。可靶向的基因突變也是臨床醫生最為關注的內容之一，截至2017年FDA已經批准了80多種腫瘤靶向藥物[42]。為了充分利用這些靶向藥物，“籃子研究”（basket study）應運而生[43]，希望達到異病同治的效果，延長腫瘤患者生存時間；並且該研究已經取得不錯的成果[44]，NGS無疑是這條道路上最有利的工具。
隨著基因測序深度和廣度的增加，更多的基因突變被發現，各家公司也基於自己檢測手段和生信分析，並根據公共數據庫（COSMIC、TCGA等）和平臺積累的數據以及一些軟件計算做出判斷，通常報告呈現的是第1、2、3類基因突變，也就是確定致病的、可能致病的和意義未明的基因突變，較為有爭議的是第3類突變，尤其是目前各平臺所引用的多為國外數據庫，其中中國人甚至亞洲人所佔比例相對較小，是否能一概而論目前無從得知，但儘快完善中國人的基因數據庫勢在必行。
隨著2017年FDA對來自商業和學術機構的醫學NGS服務的認可，NGS正式進入臨床實踐。但目前國內NGS缺乏統一規範和檢測標準，導致不同實驗室平臺檢測結果無法比較。2017年，國家衛生計生委臨檢中心對全國136家測序平臺進行腫瘤體細胞基因突變高通量測序平臺生物學分析能力評價，兩次質評合格率分別為34.5%（39/113）、65.5%（74/113），全部正確的實驗室僅為49.6%（56/113）。
正如Hayer博士所說：“一次糟糕的腫瘤標誌物檢測帶來的後果和糟糕的藥物一樣”[45]。目前除需動態監測患者腫瘤突變情況外，大部分患者僅接受1次NGS檢測，但取自同一患者的兩份完全不同的NGS報告並不是罕見現象，不是每一次的結果都能用時間異質性和空間異質性來解釋。2017年發表在JAMA上的一篇文章，對比了兩家業界頂尖公司同時檢測的34例患者的有效ctDNA樣本，僅35%（12/34）檢測報告結果相同[46]。在本科進行的12次NGS討論中，有3次是討論不同平臺檢測結果的差異。隨著NGS檢測的日益普及，如果沒有統一的標準和規範來保證檢測結果的可靠性，那麼無論對患者還是臨床醫生都是災難。
通過臨床觀察，就消化系統而言能通過NGS檢測篩出靶向基因的概率並不高，但MSI、TMB對免疫治療發揮極大指導作用。如果NGS結果出現問題，對患者不僅是金錢上的損失，更可怕的是對最佳治療時間的延誤、對生存期的影響。尤其是目前基因檢測由於時間、空間的異質性，某些檢測結果無法溯源，這也對各平臺的專業能力提出更高的要求。同時，也需要加強腫瘤臨床醫生對NGS結果的辯證意識。
總的來說，本文報道了一例送檢兩家公司進行NGS檢測的肝內膽管細胞癌患者，並從不同角度解讀了NGS報告，初步探索了NGS報告解讀方法，並發現了目前國內NGS檢測存在的部分問題。完善NGS檢測規範、結果判讀標準、建立中國人的基因數據庫是解決問題的關鍵，聯合臨床科室、病理科和NGS檢測公司進行討論的形式可加速目標的達成，也能協助腫瘤醫生更準確地制定治療方案。
參考文獻（略）
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