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Western Blot以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于定性检测蛋白水平的表达。
本文总结了Western Blot实验中常见的问题与解决方案，希望对大家有用，当然有描述不恰当的地方，欢迎批评指正。
一、 Western Blot的操作流程
二、WB操作过程中常见问题和解决方案
（1）样本问题
问题：蛋白浓度太高或者盐浓度太高；
解决：稀释样本，减少上样量或者降低盐浓度
（2）转膜问题
问题：转膜强度太强，导致目的位置上方的杂带太强
解决：降低转膜强度（时间和电流），使目标蛋白上方的蛋白少转移到膜上。
问题：转膜气泡
解决：A.转膜过程中尽量去除气泡，使膜，滤纸和胶紧密结合；
B.抗体孵育的过程中，保持膜的充分浸润。
（3）胶的问题
问题：泳道部分弯曲；
解决：可能是胶的问题；可能是上样时多余的胶孔未用1x loading buffer补齐
（4）二抗选择问题
问题：二抗选择问题；
解决：如果这种膜还在，没有干过，用1XTBST洗涤5min/3次，然后从封闭开始，重新WB接下去的步骤。
（5）抗体稀释度问题
问题：杂带多，背景大；
解决：降低上样量，增加一抗的稀释比。
（6）曝光问题
问题：条带中间显白，可能一抗或二抗加入过多；上样过多，导致中间底物消耗过快，结束之后不发光
解决：增加ECL的稀释度，减少上样量，增加一抗的稀释度。
（7）ECL液问题
问题：ECL显色过程中荧光淬灭过快；
解决：根据ECL液的特性，尽快选择显色（有些ECL液需要混匀孵育几分钟后才能达到最优的效果）
（8）条带粘连
问题：条带粘连；
解决：上样量太多，减少上样量；制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。
三、其他常见问题及解决方案
（1）显影后，检测不到信号
可能原因
解决办法
一抗和二抗不匹配
1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白
1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；
2.使用效价高的一抗；
3.延长抗体孵育时间，一抗 4℃过夜，二抗室温 1-2h；
4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；
5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。
抗原量不足
1.检测样本中目的蛋白表达较少；
2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于；
20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；
3.磷酸化抗体检测优先使用 BSA 进行封闭；
4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。
组织中目的蛋白含量低
1.选择特异表达目的蛋白的组织；
2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；
3.使用相应的蛋白酶抑制剂。
转膜不充分或电极插反没转成功
1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；
2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；
3.转膜时电极插反，导致转膜失败；
4.选择相应的转膜液；
5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。
洗膜过度
1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。
显色液失活
1.检测使用的显色液是不是有效，特别是 ECL显色中，ECL-B 特别容易失效。
显色方式的选择
1.ECL 显色比 DAB 显色灵敏度高 5-10 倍；
2.ECL 发光液分普通，灵敏，超敏，在信号上有明显的差异；
3.延长曝光和显色时间。
（2）显影后，膜上背景高
可能原因
解决办法
未进行非特异性封闭或封闭不充分
1.延长封闭条件（一般室温 1h）；
2.考虑更换合适的封闭剂（例如使用 5%脱脂奶粉）；
3.封闭的时候几张膜在一起，导致封闭不充分。
一抗浓度过高
1.调整抗体的稀释比。
抗体孵育温度过高
1.改变抗体孵育的方式（由原来的室温孵育改为 4℃孵育）。
一抗或二抗与封闭剂有交叉反应
1.更换合适的封闭液（有时候脱脂奶粉的效果封闭比较好）；
2.当用脱脂奶粉封闭背景较高时，选择 BSA 进行封闭(脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景)。
膜的选择导致的高背景
1.由于 NC 膜和 PVDF 膜与蛋白结合的原理不同，选择合适的膜。（例如选择 PVDF 膜可以增加洗膜强度）
（3）显影后，检测发现有多带现象
可能原因
解决办法
体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等
1.查阅相应的网站（例如：uniprot），查看相应的转录本信息；
2.参考其他抗体的网站信息，查询目的蛋白的分子量，和表达情况。
蛋白样本降解
1.提取的样品时间长，发生明显降解；
2.提取蛋白的时候，加入蛋白酶抑制剂；
3.样品保存得当，尽量在室温的时间减少。
一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带
1.增加一抗的稀释比例；
2.降低一抗和二抗的孵育时间。
二抗浓度过高，高浓度产生非特异性结合
1.一般二抗体系清楚，不调二抗的稀释比例，降低二抗的孵育时间；
2.降低抗体浓度，增加二抗对照（不加一抗）；
3.选择适当的孵育时间，一般为室温 60 分钟，时间过长易出现非特异性的条带。
靶蛋白形成多聚体
1.对于易于形成多聚体的蛋白，在 SDS-PAGE电泳上样前，煮沸 10 分钟而不是 5 分钟，使蛋白解聚。
（4）其他问题及解决办法
问题描述
可能原因
解决办法
内参出现两条带
样品和抗体原因
1.减少上样量；
2.增加抗体的稀释比例。
条带很浅，甚至没有
样品和抗体原因
1.选择样本是否有目的蛋白高丰度表达；
2.增加上样量；
3.降低抗体的稀释比例；
4.磷酸化的抗体选择 BSA 的封闭液；
5.样本中加入相应的蛋白酶抑制剂；
6.显色体系问题（ECL-B 液效果降低）。
Western Blot 是一个细心的技术活，实验操作过程中注意细节，例如实验室的同学经常说配好的胶中会产生气泡，这是因为我们配胶用的30%丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺、AP、TEMED等都是在4°C储存，临用前没有提前取出恢复室温，因此凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡。说了这么多，真心希望对初学者有用。
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