儘管人們對CRISPR-Cas9基因編輯抱有很高的期望並且已經進行了大量的投入，但科學家仍然不清楚它如何在人體中發揮作用。
在一項最新的研究中，加利福尼亞大學伯克利分校的科學家發現人們調控CRISPR修復效率的關鍵是Fanconi貧血途徑。該研究於7月27日在線發表在nature genetics上。
本文通訊作者Jacob Corn教授表示：“基因編輯是超級強大的，有很多希望，但到目前為止，也存在大量的試驗和錯誤。它在人體細胞中起作用的方式一直是一個有很多假設的黑匣子。而現在，我們終於開始瞭解正在發生的事情。”
這一發現深入探討了為什麼CRISPR-Cas9基因編輯為什麼沒有在所有細胞中都取得同樣的成功。它可以幫助研究人員提高將新DNA插入基因組的效率，例如用正確的DNA序列替換有害突變，並且調整CRISPR-Cas9編輯以獲得所需的結果。
CRISPR依賴於DNA修復
CRISPR-Cas9具有革命性，因為它能夠精確地利用基因組中數十億的特定DNA序列並切割雙鏈DNA分子。但在此之後，由細胞來修復損傷。
雙鏈DNA斷裂（DSB）的修復可以通過兩種方式進行：
- 非同源末端連接（NHEJ），不需要DNA模板，似乎是CRISPR切割後最常見的結果；
- 同源定向修復（HDR），在某些類型的細胞中比其他細胞更頻繁地發生，並且需要存在可用於修補DSB的DNA片段以代替錯誤序列。
然而，這兩個過程都有點神秘，沒有人知道為什麼有些細胞很容易利用DNA進行修復，而其他細胞很少這樣。
另外，同源定向修復（HDR）還分為同源重組修復和單鏈模板修復（SSTR），它們的DNA供體分別是雙鏈DNA（dsDNA）（線性和質粒）以及單鏈寡脫氧核糖核苷酸（ssODNs）。
在大多數細胞類型中，從dsDNA供體修復效率相對較低，並且假設利用的是一種與減數分裂同源重組相似的修復機制。相比之下，SSTR在人體細胞中高效（> 20％的等位基因）並且在後生動物中廣泛保守 。
建立篩選平臺：檢測CRISPR介導的SSTR的相關通路
在篩選人類癌細胞系時，研究人員發現在給定基因座處以SSTR為主的基因組編輯可以從完全無效（0％SSTR）到非常有效（30％SSTR），具體取決於細胞背景。這意味著在不同背景下基因或轉錄的差異能上調或下調基因編輯。因此，研究人員決定檢測與CRISPR-Cas9介導SSTR的相關通路。
首先，他們開發了一個能夠在人體細胞中檢測多種編輯結果的耦合抑制-編輯篩選平臺，結合數千種單個CRISPR抑制（CRISPRi）Cas9編輯基因的單拷貝，基因組整合藍色熒光蛋白（BFP）報告基因。篩選池中的各個細胞穩定表達dCas9-KRAB CRISPRi構建體以及一個靶向轉錄起始位點基因的gRNA。然後將該池與預成型物進行核轉染，包括靶向BFP報告基因的Cas9-gRNA RNP複合物和一個編碼3-bp密碼子將BFP轉換成綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的ssODN。
然後，編輯後的細胞通過熒光激活細胞分選（FACS）進行分離，分為未編輯的（BFP + / GFP-），插入缺失（BFP- / GFP-） 和SSTR編輯（BFP-/ GFP +）。接下來，通過Illumina測序來比較哪些靶基因促進（編輯的細胞中下調的gRNA）或限制（編輯的細胞中富集的gRNA）具體的基因組編輯。
Fanconi途徑在SSTR修復中起關鍵作用
為了確定Cas9介導的SSTR所需的因素，研究人員使用FACS分離GFP +細胞，並測量其相對於未分類的編輯池的gRNA丰度。
結果中，最引人注目的是，相對於未分類的編輯細胞，Fanconi途徑（FA）中70％（28/40）的基因在GFP+細胞中被強烈地耗盡。因為Fanconi途徑（FA）先前被認為是一個對Cas9介導的基因組編輯不重要的修復系統，並且通常被認為是鏈間交聯而不是核酸酶誘導的斷裂的反應。而此次研究中的生物基因集丰度分析也證實：一般的DNA修復和特別是FA途徑是SSTR的一個定義特徵。
丨Fanconi途徑
該途徑涉及21種不同的蛋白質，因為如果編碼這些蛋白質的任何基因受損，就會產生Fanconi貧血症，這是一種罕見但嚴重的遺傳性疾病，患者骨髓不能產生足夠的血細胞。該疾病伴隨著出生缺陷和癌症高風險，患者在童年時發生白血病的幾率為10％，並且很少有患者活到30歲以上。
該途徑已被人們所知並研究了數十年，但人們普遍認為它可以修復一種特殊的DNA損傷：DNA鏈間交聯，即其中一條DNA鏈上的核苷酸與相鄰鏈上的核苷酸緊密結合，干擾DNA複製並經常殺死細胞。
FA途徑介導NHEJ和SSTR之間的平衡
下一步，研究人員對導致鐮狀細胞病的血紅蛋白亞基β（HBB）基因座（Glu6Val）進行了編輯，他們發現全部七個FA因子都是SSTR編輯所必需的。值得注意的是，FA的基因敲低降低了SSTR水平，同時增加NHEJ的水平，最終總編輯水平保持相對穩定。
而在沒有ssODN的情況下編輯HBB基因座時，FA的基因敲低沒有顯著增加NHEJ頻率，並且在編輯BEP基因座時得到了類似的結果。這說明，FA途徑不影響NHEJ。
另外，在人成纖維細胞的基因編輯中，通過siRNA敲低FA修復途徑中的FANCA或FANCE，SSTR減少了約五倍。
在沒有ssODN情況下，FA修復途徑既沒有影響整體的頻率也沒有影響插入缺失的方式。相反，當使用ssODN進行編輯時，SSTR在FA修復途徑受到干擾時顯著降低。
總之，FA途徑的作用僅限於SSTR修復和NHEJ和SSTR之間的平衡 ，在易出錯的末端連接途徑（NHEJ）中沒有直接作用。
丨SSTR依賴於FA基因下游的特定亞複合物
FA基因一般通過依賴特殊的亞複合物來保持基因組的穩定性，其中一部分是解旋酶，包括布魯姆綜合徵蛋白（BLM）和3'-5'DNA POLQ樣解旋酶（HELQ）來對抗異常的染色體結構和複製應激。
因此，研究人員通過對BLM和HELQ的敲低發現BLM對SSTR沒有影響，但HELQ能顯著影響SSTR。HELQ還能與BCDX2重組亞複合物（RAD51B，RAD51C，RAD51D和XRCC2）相互作用，但與CX3子複合體無關（由RAD51C和XRCC3組成）。這些複合物都能促進ssODN和基因組DNA之間的重組。
於是，研究者還研究了這些複合物是否會影響SSTR，他們發現RAD51C是SSTR所必需的，但RAD51B和XRCC2不是。這表明BCDX2複合物在SSTR中不起作用。相反，RAD51C和XRCC3都是SSTR所需要，表示CX3子複合體在SSTR中起作用。
未來的工作應找出FA途徑如何與聚合酶和介導重組的基因相互作用，這或許將為SSTR的機制及其與維持基因組穩定性的其他途徑的相互作用提供有價值的見解。
FA途徑的核心組分
定位於Cas9介導的雙鏈斷裂位點
FANCD2是FA途徑的核心參與者，在鏈間交聯和紫外線損傷時均可檢測到。因此，研究者用染色質免疫沉澱測序（ChIP-seq）確定了FANCD2響應Cas9編輯的全基因組定位。
令人驚喜的是，對幾種細胞的進行基因編輯，包括K562（慢性骨髓性白血病細胞）、HEK293（人胚腎上皮細胞），發現FANCD2在編輯的目標位點（on target）上顯示大量富集，極少在脫靶位點（off target）出現富集，並且沒有在未報道過的脫靶位點上出現富集。
基於此，研究人員提出了一種模型，即FANCD2能定位於Cas9編輯後的雙鏈斷裂位點 。這可能是通過殘留物Lys561的單泛素化使下游活化，控制下游的修復結果。這也表明FANCD2在CRISPR-Cas9基因編輯的調節中起重要作用。
FA途徑充當交通信號
其活性水平或影響CRISPR-Cas9效率
綜上，整個FA途徑影響末端連接和同源定向修復之間的平衡，充當交通信號。末端連接是DNA雙鏈斷裂後的默認修復機制，但FA途徑與其競爭，並且更高的活性將導致更多的同源定向修復（HDR）和更少的末端連接。因此，FA途徑的活性水平可能會影響CRISPR在特定細胞中插入DNA的效率。
其次，該途徑中的21種蛋白質之一FANCD2始終位於CRISPR-Cas9產生的雙鏈斷裂位點，意味著或許可以通過調節FANCD2的表達以提高細胞通過同源定向修復（HDR）插入DNA的頻率。另外，通過繪製基因組中FANCD2的位置即可找到基因編輯目標和目標外的切割位置。
然而，FA途徑在修復CRISPR斷裂中的重要性使人懷疑一些使用HDR修復的CRISPR治療方法。因為沒有活躍的FA途徑，在Cas9切割後，細胞可能無法通過HDR修復來將正常基因替換其突變基因。
而更具前瞻性的是，FA途徑相關因子的表達水平可作為患者細胞“可編輯性”的生物標誌物，增強FA途徑的活性可能在難以編輯細胞的治療中特別有價值。
https://www.nature.com/articles/s41588-018-0174-0
http://news.berkeley.edu/2018/07/30/dna-repair-after-crispr-cutting-not-at-all-what-people-thought/
https://www.sciencedaily.com/releases/2018/07/180730161843.htm
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