摘要：分子編寫可進行以下四方面工作：（1）新型育種標記的創制及驗證；（2）跨物種分子編寫；（3）基因組中鹼基序列的刪除；（4）物種內分子編寫。該育種技術可以不通過有性雜交，只引入一個或幾個目標基因或SNP，快速獲得目標性狀突出的遺傳穩定新種質，然後結合常規育種方法育成新品種。該方法將實現真正的個體和群體水平的基因（或分子）雜交育種，獲得分子雜種優勢，能夠高效的解決長久以來困擾育種工作的諸多難題，大大提高育種效率，尤其在畜禽育種中具有重要應用前景，將會是未來育種的發展方向。
本文將詳細論述常規動物育種技術的現狀和難點以及分子編寫育種方法的基本概念、研究手段、研究內容、研究現狀並展望其發展前景和對育種工作的影響，為動物育種、畜禽養殖以及相關政策制定提供參考。
一、動物育種的現狀與難點
培育動物新品種的主要方式是雜交育種和選擇育種。以豬的育種為例，所有的現代種豬幾乎都是通過不同品種的豬雜交併長期選育而成的。《英國大百科全書》記載“現在歐洲的豬種，是當地豬種與中國豬雜交而成”。比如著名的約克夏豬（Yorkshire）和巴克夏豬（Berkshire）都是將廣東豬種和英國當地豬種雜交，並經過長期選育而形成的。美國的切斯特白豬（Chester White）、波中豬（Poland China）則是在1817年引進華南豬雜交改良並長期選育而成。
雜交育種為動物養殖業的發展做出了巨大的貢獻。中國從20世紀50年代開始，開展了廣泛的“土洋”豬雜交育種。通過地方品種與引進品種的雜交，把引進品種的瘦肉率高、日增重快、飼料轉化率好的特點與我國地方品種的繁殖力高、肉質好、適應性強的特點結合在後代中，再通過連續不斷的選擇，培育出大量優質、高效的生豬新品系和配套系。而且到目前為止，雜交技術也是一項在常規的商品豬生產中廣泛使用的技術，用於生產各種經濟性狀均較為理想的雜種商品豬，如杜長大三元雜交豬等。
但是雜交育種存在明顯的不足。一是不同品種豬雜交後，後代在引入優質基因的同時，也引入了大量劣性基因，為了選育出優良的雜交後代，必須配備大量的人力並長期進行觀察和測定。這種選育過程要不斷持續幾十年之久。如今風靡世界的長白豬、大白豬等著名品種，都是經過將近百年的選育才培育成功。漫長的選育過程導致動物新品種培育的人力成本、時間成本和經濟成本居高不下。
二是常規的選育方法無法對那些難以觀察和測定的複雜性狀進行選育。比如抗病性狀在不發病時無法觀察，而在持續攻毒的條件下進行測定和選育又會對養殖場造成巨大的感染風險。另外測定成本較高的飼料轉化率性狀、肉質性狀以及低遺傳力的繁殖力等性狀，用常規育種方法進行選育不僅成本高、可操作性差，而且選育進展也比較緩慢。隨著環保要求以及消費水平的不斷提升，規模化養殖和優良肉質品種將是未來動物養殖業的普遍需求，這就要求動物新品種的培育要向高抗病能力、優良肉質等方向發展，而這兩方面恰恰是常規選育方法無法發揮其長處的地方。
三是雜交育種本身的規律就決定了，即便經過漫長的選育，劣性基因也不一定能完全從雜交後代中排除。根據基因的連鎖和交換定律，染色體上相距很近的兩個基因常常是連鎖在一起的，作為一個單元進行遺傳。所以不管如何延長選育時間，那些與優質基因連鎖的劣性基因依然會存在。
二、分子編寫育種的內容及研究現狀
分子編寫的研究內容主要包括：新型育種標記的創制及驗證、跨物種分子編寫、基因組中鹼基序列的刪除以及物種內分子編寫等四項（圖1）。
1、新型育種標記的創制及驗證
遺傳標記在育種中發揮著重要作用，但是目前已發現的有效的遺傳標記如主效基因、因果SNP位點等數量有限，非常不利於育種產業的發展。
另一方面，也可以綜合已有的不同品種豬的基因組數據、SNP數據、全基因組關聯分析結果等生物信息學數據和文獻，篩選與豬抗病、生長速度、瘦肉率、產仔數、肉質等重要經濟性狀因果相關或緊密相關的各種遺傳標記（如SNP位點、酶切位點、結構變異、拷貝數變異等）、表觀遺傳標記（如microRNA、lncRNA、DNA甲基化修飾等）。
以上兩種方式獲得的遺傳標記，可以進一步通過體細胞克隆的方法進行精準驗證。例如驗證SNP位點與目的性狀的相關性（圖2），就可以先利用分子改編技術的高精準性從同一個細胞系構建出多個SNP差異細胞系，然後再利用體細胞克隆動物細胞核遺傳一致性，構建SNP差異群體。這個群體理論上具有完全一致的遺傳背景，只在目標SNP位點存在單鹼基差異。進一步分析SNP差異群體的表型，就能驗證SNP位點與目標性狀的相關性，及其對目標性狀的貢獻度。這種方法避免了全基因組選育中依賴算法造成的統計學誤差，能更準確地驗證SNP位點對目標性狀的貢獻度，從而獲得因果SNP位點。
構建的SNP差異群體除了可以精準驗證SNP對目標性狀的貢獻外，還可深入研究SNP影響目標性狀分子機制，以及挖掘與目標性狀相關的其他遺傳標記的好材料。比如在同一品種、同一來源的細胞中實現單核苷酸的“轉換”或“顛換”培育的SNP差異群體，它們在遺傳背景上基本完全一致，這時不僅可以直接驗證SNP對目標性狀的貢獻度，還可以通過高通量測序、功能基因組學及表觀遺傳學深入分析其分子機制。
而在不同品種間的細胞中分別實現單核苷酸的“轉換”或“顛換”培育的SNP差異群體，其SNP變異相同，但遺傳背景不同，這時就可以深入挖掘、篩查與目標性狀相關的其他遺傳標記（圖2）。
綜上所述，利用分子編寫技術不僅能規模化的精準創制遺傳突變，便於發現新型遺傳標記，更可以精準驗證SNP位點對目標性狀的貢獻度，改變目前全基因組選育中完全依賴算法造成的統計學誤差，從而獲得一批具有高度育種價值的因果SNP位點，形成自主知識產權及核心技術。另外在進行SNP驗證時，還可以進一步解析SNP位點影響目標性狀的分子機制，挖掘和篩查與目標性狀相關的其他遺傳標記。
2、跨物種分子編寫育種
跨物種分子編寫育種，即通過ZFN、TALEN或者CRISPR/Cas系統以及顯微注射技術、體細胞核移植技術將一個物種中的基因精確插入或替換到另外一個物種基因組的特定位置中，或者在一個物種的基因組特定位置上，模仿另一個物種基因組中特定位置的鹼基序列信息。常見的是將外源基因插入或替換到某一物種基因組上的特定位點中，如友好基因座中。該方法不僅能打破物種間的生殖隔離，引入外物種的優良基因，而且能在大大降低非預期效應的同時，充分發揮外源基因的育種價值。現有的跨物種分子編寫育種研究可以分為以下三類：外物種基因的精確插入，外物種基因的精確替換以及外物種突變序列的模仿。
1）外物種基因的精確插入
外物種基因的精確插入目前已有報道。其主要方法是將具有特殊功能的外源基因的完整表達框，精確的定點整合到受體動物基因組中的特定位置中。使其整合位置以及表達模式完全可控，避免傳統轉基因技術中的非預期效應的產生。目前常選擇動物基因組中的“友好基因座（safe harbor）”進行定點整合。友好基因座是指動物基因組中轉錄活躍且不影響動物生長、發育和生殖的基因位點，這些位點非常適合外源基因的表達，對外源基因是友好的，因此稱為友好基因座。在開發和利用友好基因座進行外物種基因的精確插入方面，我國的科研工作者走在了世界前列。中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院鑑定出豬的Rosa26友好基因座，並在該位點實現外源基因的定點插入和替換。
西北農林科技大學利用CRISPR/Cas9n切口酶系統將結核抗性基因NRAMP1定點整合到奶牛基因組的友好基因座F-A位點中，不僅建立了一套高效、低脫靶率的將外物種基因精確插入奶牛基因組的技術體系，而且有望利用此成果培育出抗牛結核病的新型奶牛品種，市場潛力巨大。
2）外物種基因的精確替換
在外物種基因的精確替換方面，美國密蘇里大學通過CRISPR/Cas技術將豬CD163基因的第7外顯子精確替換為人的同源序列。豬CD163蛋白是巨噬細胞表面的一種蛋白，在豬繁殖與呼吸綜合徵病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染過程中能介導PRRSV病毒進入巨噬細胞，而人的同源蛋白卻不介導PRRSV的感染，從而使得PRRSV病毒無法感染人類。該研究精確替換了CD163基因的第7外顯子，不僅能深入探索PRRSV病毒感染機制，更有望在保留豬CD163蛋白基本功能的前提下，刪除CD163對PRRSV病毒的介導作用，從而培育出既能抵抗PRRSV病毒，又不會因CD163敲除而可能攜帶某些缺陷的新型抗病豬。
3）外物種突變序列的模仿
3、基因組中鹼基序列的刪除
分子編寫育種的第二方面是：基因組中鹼基序列的刪除。除了打破生殖隔離，跨物種的引入基因或鹼基突變外，分子編寫育種還包括在同一物種內對基因組進行精細操作，精確刪除基因組上的某些無用甚至有害的鹼基序列。比如在進化中整合到基因組上的內源性逆轉錄病毒、導致應激綜合徵的基因、疾病易感基因以及某些病毒或細菌的受體基因等。將這些基因或序列精確的剔除掉，就能定向培育出更為優質，更符合人類、養殖、食用醫藥研發等多種不同需求的生物新品種。
1）內源性冗餘序列的刪除
豬的內源性逆轉錄病毒是在長期進化過程中整合到豬基因組中的，對豬本身已經沒有毒性，但是在進行異種器官移植時卻有可能對人體安全造成威脅。通過分子編寫，美國哈佛大學的楊璐菡團隊成功刪除了豬基因組中幾乎全部的逆轉錄病毒序列，並通過體細胞克隆技術獲得了世界上首批適合進行異種器官移植的無內源性逆轉錄病毒的小型豬，該研究對培育異種器官移植用小型豬新品種具有重大意義。同樣，通過分子編寫技術，刪除其他物種基因組中的內源性病毒序列，也能夠培育出更安全，適用於醫學研究和應用的生物新品種。
2）負作用基因和因子的刪除
牛奶和羊奶中的β-乳球蛋白是人乳中不含有的蛋白，是奶製品中的過敏原之一。通過分子編寫技術將牛或羊基因組中的β-乳球蛋白基因敲除，從而可降低牛羊乳中過敏原的含量，培育出不含β-乳球蛋白的牛羊新品種，緩解部分人群牛乳過敏症狀。2011年，中國農業大學利用ZFN技術成功敲除牛基因組中的β-乳球蛋白基因，獲得β-乳球蛋白敲除的奶牛，為培育低過敏原奶牛打下了良好的基礎。
3）與疾病易感相關基因和因子的刪除
抗病能力是動物育種中具有重要經濟價值的一種表型。但是傳統育種手段在選育抗病品種時缺乏合適的指示性狀，而攻毒後再測定則成本高昂，並會對生產有不利影響。分子標記輔助育種存在分子標記較少，各個抗病分子標記間的關係複雜，抗病性狀與部分生產性狀存在拮抗等多種問題。因此抗病動物品種的培育工作一直進展緩慢。而分子編寫育種則可以通過直接刪除疾病易感基因或者病毒受體基因，快速培育具有抗病性狀的動物新品種，將大大加快抗病動物新品種的培育速度。
動物傳染性海綿狀腦病（transmissible spongiform encephalopathy,TSE）是一種可以感染人類和牛、羊等動物的致死性中樞神經系統疾病。這種疾病不僅對牛、羊等動物養殖業造成巨大損失，還直接威脅著人類健康。通過動物分子編寫技術，敲除動物中引起TSE疾病的PRNP基因，就能獲得抗TSE的動物。如敲除PRNP基因的抗瘋牛病牛，和抗羊瘙癢病綿羊、山羊等動物新品種。這類抗TSE動物新品種的進一步推廣和應用，將會大大提升畜牧業生產和人類健康的安全保障。
4、物種內分子編寫
育種分子編寫育種的第三方面是：物種內分子編寫育種。常規的雜交育種手段無法精確的將“好基因”和“壞基因”分開，因此往往在導入優質基因的同時也導入了大量的劣性基因。尤其是那些互相連鎖的基因，常規的雜交育種手段是無法分開的。物種內分子編寫育種就能解決這一問題。分子編寫育種可以在同一物種內對動物基因組進行精細操作，模仿同一物種中其他品種上的鹼基突變或SNP位點，將多個品種的優質遺傳突變信息，如基因突變以及啟動子、增強子、內含子等多種非編碼區域上的SNP位點、突變序列等模仿和替換到一個品種上，實現真正意義上的“分子雜交”。
比如在豬的育種中，分子編寫育種可以精確的將地方豬的肉質優良、抗逆性強的基因替換到商用品種中，或者將商用品種生長速度快、飼料利用率高、瘦肉率高的基因替換到地方品種中。甚至可以精確的實現品種間、個體間鹼基突變或SNP位點的模仿，直接獲得分子雜種優勢，替代有性雜交，實現真正的豬個體和群體水平的“分子雜交”育種。
通過對“瘦肉型”和“肥肉型”豬的QTL分析發現，“瘦肉型”豬（如大白豬、皮特藍豬）與“肥肉型”豬（如野豬、梅山豬）相比，其類胰島素生長因子2（Insulin-like growth factor2,IGF2）的第三內含子的第3072位鹼基存在G到A的SNP位點，該SNP位點對豬的生長速度、瘦肉率、背膘厚、背最長肌面積以及心臟重量等性狀有著非常顯著的影響，可以使豬的肌肉量增加15%—30%，背膘厚減少10%20%。該SNP位點應該是在“瘦肉型”豬的培育過程中自然突變後經過漫長的人工選育固定下來的。如果通過物種內分子編寫育種，將該SNP位點直接精確的引入到我國地方品種豬中，就能快速的提高我國地方品種豬的產肉性能，對我國地方品種豬的改良意義重大。
在歐洲和美國的奶牛養殖業中，常常出於生產安全以及對工作人員的保護將奶牛的角去掉。但是去角的過程不僅增加了養殖成本，對奶牛來說也非常痛苦，與動物福利和動物保護的宗旨不符。目前已選育出某些肉用品種的牛有無角性狀，如安格斯肉牛（Angus cattle），其無角性狀主要由1號染色體上的POLLED基因決定。如果通過雜交育種的方法培育無角奶牛，不僅需要非常長的選育時間，而且雜交後代的產奶性能一定會受到肉牛某些基因的影響，產奶性能會降低。TAN等利用TALEN技術成功將肉牛的無角基因POLLED定點整合到有角奶牛的基因組中，由此可培育出既保持高生產性能，又無角的奶牛新品種，免除了奶牛切角的痛苦。
禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）極大的威脅著禽類養殖業和人類健康。培育能抵抗禽流感的禽類動物，一直以來都是養殖和育種從業人員的夢想。2011年，英國羅斯林研究所通過轉入干擾RNA來抑制禽流感病毒的增殖，獲得了較好的抗病效果。未來則可以藉助分子編寫技術，將其他品種中對禽流感病毒有抵抗力的基因直接模仿和替換到生產性能較高的品種上，進而快速獲得對禽流感病毒具有一定抵抗力的新品種動物。
2015年，一種能快速生長的轉基因三文魚——水優三文魚（aquAdvantage salmon）通過美國食品藥品監督管理局（food and drug administration,FDA）的審批，獲准上市銷售。2017年，首批水優三文魚已經正式上市銷售。這種三文魚本身為大西洋三文魚（atlantic salmon），轉入了另外一種三文魚——大鱗三文魚（chinook salmon）的一個生長激素調節基因，以及一個來自美洲大綿䲁（ocean pout）的啟動子，用來調節生長激素的合成，從而使得它們能夠全年生長，因此生長速度比普通三文魚快一倍，節省約75%的飼料。該品種採用的是傳統的轉基因技術，因此經歷了較為漫長的審批過程。如果採用品種內分子編寫技術，將其他品種三文魚的優質基因或啟動子序列替換到大西洋三文魚中，相信將更加容易獲得消費者的認可。
三、分子編寫育種流程
分子編寫育種的目的是改良品種並將優良的遺傳基因傳遞至商品代。因此除了上述的對動物基因組的分子操作外，分子編寫育種還需要緊密結合目前廣泛使用的常規育種方法，持續對分子編寫群體進行選配、測定、評估，根據評估結果選擇優良個體建立核心群（圖1）。然後依次建立純種擴繁群商品生產群，將優良基因傳遞給商品群。在核心群的建立和維持過程中，測定和評估是關鍵環節。不僅要進行性能測定、體型評估等常規測定，還需要進行基因測定，獲取其遺傳標記信息，以便通過全基因組選擇和測序分型進行更準確的選種。也就是說，通過分子編寫技術獲得的、遺傳性狀得到“質變”的群體，還需要結合全基因組選擇、標記輔助選擇等多種育種方法進一步不斷選育、不斷迭代、不斷積累“量變”，才能保持遺傳性狀的優良。
四、分子編寫育種的前景
綜上所述，分子編寫育種一方面可以在物種間實現優質基因或序列甚至是SNP的流動、替換，打破物種間的生殖隔離，充分發揮優質基因的育種價值。另一方面可以在物種內真正實現個體和群體水平的分子雜交育種，快速獲得具有分子雜種優勢的生物新品種。跨物種分子編寫育種與轉基因技術相比，精確性大大提高，因此可以大大降低外源基因隨機整合以及表達量不可控導致的非預期效應，更加精準，更加高效，更加安全。而物種內的動物分子編寫育種，在真正實現分子雜交的同時，完全不含其他物種的DNA序列，在本質上與傳統育種方法獲得的個體完全沒有差異，可以說等同於傳統育種方法獲得的遺傳變異個體。
除不斷提高CRISPR/Cas技術的精確修復能力外，CRISPR/Cas技術的特異性也已經得到極大的改善。主要優化方法可分為對Cas9蛋白的改造和針對sgRNA的改進。在Cas9蛋白的改造方面，其主要策略包括將Cas9蛋白的核酸內切酶失活，只保留DNA識別能力，同時與其他核酸內切酶融合形成複合體，如FokⅠ-dCas9複合體，進而提高對靶序列切割的特異性。其次是對Cas9蛋白進行點突變，篩選與DNA結合特異性更高的突變體，如增強型eSpCas9、高保真型Cas9-HF1等。針對sgRNA的改造是改變sgRNA的長度，研究表明在sgRNA的5’端的減少2—3個鹼基或在識別序列前加2個鳥嘌呤，能夠在不影響切割活性的情況下，降低脫靶率大約5000倍。
單位：中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，陸軍軍醫大學基礎醫學院實驗動物教研室，深圳市金新農科技股份有限公司
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