来源：探癌
1、我们先来了解概念，什么是液体活检？
液体活检是采用包括血液、尿液、唾液、胸水、腹水、脑脊液等在内的人体体液，作为检测样本的一类非入侵性的检测方法。
2、为什么癌症领域要做液体活检呢？
液体活检作为一种新兴的癌症检测技术，能够非侵入性地反映体内肿瘤状态，并可应用于肿瘤的早期筛查和诊断、转移和进展、耐药性、预后评估、监测复发、微小残留病灶检测、肿瘤的异质性进化以及建立基因表达谱等领域，其在这些领域拥有技术优势和广泛的临床应用价值。根据肿瘤相关物质的类型，液体活检涵盖了循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、细胞外囊泡(EVs)和循环肿瘤RNA(ctRNA)等检测靶标。
现阶段，液体活检关联的市场增长非常快。全球液体活检市场从2018年的12.44亿美元增长到2025年的约120.62亿美元，2019年至2025年间的复合年增长率达38.3％【1】。这一市场包括CTC、ctDNA和外泌体应用的硬件(包括系统和设备)和试剂盒销售，以及服务收入。目前，液体活检分析物还是主要集中在 ctDNA 和 CTC 的捕获和分析上。整个市场的产业化发展也很迅速，目前已有多项液体活检产品获准进入临床，更有许多转化研究在蓬勃开展。尽管液体活检技术的临床应用仍然面临着诸多挑战，标准化与质量管理体系还有待完善，但是液体活检作为应用前景广阔的检测新技术，将成为临床迫切需求并值得信赖的诊断工具，特别是在已上升到了国家战略高度的癌症早诊领域的应用。癌症的早期诊断目的是为了减少在晚期被诊断出的患者的比例，在尽可能早的阶段提供护理来改善癌症结果（图1）。
图1 各癌种中早期诊断和晚期诊断的5年生存率比较
早在2016年，在The Lancet Oncology杂志在发表了一篇述评《癌症液体活检：癌症检测的未来？》【2】，在这篇述评中对GRAIL公司的一项计划——“通过血液筛查及早发现无症状个体的癌症”（the early detection of cancer in asymptomatic individuals through a blood screen）进行了讨论。GRAIL公司的这个计划旨在创建一种通用的血液检测方法，从而可以对无症状个体进行多种类型的癌症筛查。文中提到了ctDNA应用于肿瘤领域的一些难题需要去克服：
(1) 首先，目前还没有通用型的用于筛查任何疾病阶段或癌症类型的ctDNA产品，是因为检测低浓度的ctDNA很难，突破这一局限性需要通过更灵敏的技术来克服，但敏感度的提高会导致来自胚系的噪声增加，这反过来又会使技术人员很难区分肿瘤相关的DNA突变和非肿瘤相关的DNA突变，从而导致检测结果假阳性的风险增加。
(2) 第二，ctDNA检测到底会检测到什么，这项检测可以区分什么？例如，并不是所有的癌症都与早期基因突变有关，而且许多癌症都有可能在任何疾病阶段、以不可预测的方式出现的多个基因突变，除非发现一种新的、尚未发现的泛癌标志物，否则通用型的ctDNA检测的设计会比较复杂。
(3) 第三，并不是所有的肿瘤都以同样的方式将ctDNA释放到血液中。相反，研究表明，ctDNA浓度不仅与肿瘤负荷直接相关，而且与克服血脑屏障或粘液组织等障碍进入血液的难易性有关。
(4) 第四，任何新的诊断检测都必须经过临床验证，这是监管批准的必要步骤，因此，ctDNA检测在肿瘤领域的应用需要有更多的临床验证。
(5) 第五，临床医生等如何处理泛癌检测结果的有关信息也是一个问题，因为早期检测是为了降低与癌症相关的死亡率，然而，在无症状的未经选择的人群中进行筛查的价值仍然存在争议，过度治疗仍是一个令人担忧的问题，过度治疗可能会严重恶化生活质量，带来与初心相反的后果。
最近，The Lancet Oncology杂志发表的一篇述评《癌症检测：对所有人进行液体活检的探索》【3】，这篇述评对4年前的述评《癌症液体活检：癌症检测的未来？》提到的关于ctDNA在肿瘤早筛早诊中几个问题做出来回应（也就是对上文提到的几个问题做出了回应）。文章提出，基于在今年发布的两项新的研究——CCGA研究和DETECT-A试验结果能帮助解答我们对ctDNA肿瘤早筛早诊应用的一些疑惑。这两项研究的初步结果也令人鼓舞。我们来看一下这两项研究公布的结果情况。
CCGA研究（The Circulating Cell-free Genome Atlas study）【4】
CCGA（NCT02889978）是一项前瞻性、多中心、病例对照和纵向随访的观察性研究。该研究是由Garil公司启动的循环游离基因组图谱研究临床实验项目，旨在在无症状肿瘤患者血液中发现肿瘤DNA，并对肿瘤进行早期筛查和诊断。CCGA研究共分为三个预先设定的子研究（图2）：① 发掘研究；②用选定的分析来进行进一步分析验证，以及③进一步验证。第一个子研究的目的是确定进一步开发的最高性能的检测方法，因此第一个子研究包括三种独立的、全面的测序方法。这3种测序方法包括：针对cfDNA和白细胞进行靶向配对测序，以检测单核苷酸变异、小片段的插入和（或）缺失突变；对cfDNA和白细胞进行WGS（全基因组测序），以检测拷贝数变异；通过WGBS（全基因组DNA甲基化测序），检测cfDNA甲基化的异常。研究结果发现WGBS优于靶向测序和WGS。在第二个子研究中，基于第一个子研究的结果，选择了基于甲基化的分析方法进行进一步开发，该结果目前已经公布。第三个子研究即将进行。
图2 Garil公司启动的CCGA研究的3个子研究
CCGA第二个子研究包括4841名参与者，分为中训练集（n=3133，1742例癌症和1391例非癌症）和独立验证集（n=1354，740例癌症和614例非癌症），以及354个样本被保留用于肿瘤活检的参考集。这些参与者涵盖了超过50种原发癌症类型，以及疾病的所有临床阶段。
该子研究结果在今年ESMO上公布，研究结果显示：
① 训练集和验证集结果一致；
② 在验证集中，cfDNA靶向甲基化分析检出癌症的特异性为99.3%，假阳性率0.7%；
③ 在预先指定的12种癌症类型（肛门、膀胱、结肠/直肠、食道、头颈、肝/胆管、肺、淋巴瘤、卵巢、胰腺、浆细胞瘤、胃）中，I-III期肿瘤的敏感性为67.3%；在所有癌症类型中的敏感性为43.9%；
④ 随着肿瘤分期的增加，肿瘤的检出率增加；在指定的癌症类型中，I期的敏感性为39%，II期为69%，III期为83%，IV期为92%；在所有的癌症类型中，I期的敏感性为18%，II期为43%。III期为81%，IV期为93%；
⑤ 在有癌信号的样本中，有96%的样本追溯了其肿瘤组织的起源；肿瘤组织起源的定位准确率达到93%。
cfDNA的靶向甲基化分析可同时检测和定位50多个癌种，并能够在所有的疾病阶段检测到肿瘤（I–III阶段敏感性为43.9％；I–IV阶段敏感性为54.9％），检出肿瘤的特异性> 99％，假阳性率<1％。
DETECT-A试验
（Detecting cancers Earlier Through Elective mutation-based blood Collection and Testing）【5】
DETECT-A试验是一项探索性的前瞻性的干预性研究，以评估包含cfDNA突变和蛋白质生物标志物的血液检测应用于肿瘤早筛，并将血液检查与全身PET-CT相结合。
DETECT-A试验中，在患者启动癌症诊断检查之前包含了三个步骤（图3）：
（1）首先，评估基线时期的外周血液样本，在基线时至少有一个生物标志物的值存在异常的个体会被邀请提供第二份血液样本；
（2）通过第二份血液样本以确定基线时期存在异常的标志物是否持续异常，并严格排除由于克隆造血等因素引起的突变，排除其他因素后，如果确认存在生物标志物的持续异常情况，则认为血液测试呈阳性；然后由来自几个相关领域的专家组成的多学科审查委员会，对血液检测呈阳性的个体的病史进行审查，以排除任何引起异常结果的潜在非癌相关原因，如果没有发现引起标志物持续异常的非癌原因，这部分参与者则接受第三部分PET-CT测试；
（3）PET-CT成像用于确认血液检测结果，并以安全和微创的方式定位潜在的癌症。
图3 DETECT-A试验时间线
在DETECT-A研究的基线时期，在9911名参与者中，490人（4.9%）血液检测结果为阳性，在这些测试中，进一步血液检测确认134人（9911名参与者中的1.35%）血检为阳性。在这134名血检阳性的参与者中，127人接受了影像学检查，其中有64人（50%）是有癌症相关的影像学检查，而在这64名参与者中，有26名（41%）随后通过活检或其他明确的证据被证实患有癌症。这26名血检呈阳性的癌症患者可以被认为是通过验血发现的癌症，其中9例为肺癌，6例为卵巢癌和2例为结直肠癌。而且这26例患者中，有17例（65%）是局部性或区域性的肿瘤，其中包括了5例I期肿瘤患者。
研究数据显示，在血液基线检测为阳性但没有经过第二次血检确认的参与者中，其血检的特异性为95.3%，而经过2次血检确认为阳性的特异性为98.9%，血液检测的阳性预测值（PPV）同时从5.9%增加到19.4%。将血液检查与全影像学相结合，特异性和PPV进一步增加，分别上升至99.6%和40.6%（图4）。
图4 DETECT-A研究中检测的性能
在DETECT-A试验中，将血液检查（cfDNA突变+蛋白标志物）与影像学（全身PET-CT）相结合进行癌症筛查，其特异性大于99%，在检测结果为癌症的患者中有65%的癌症处于早期。
从爆发的临床研究我们不难看出，液体活检应用于癌症早筛早诊离我们越来越近，结合液体活检方法与当前的筛查手段，可能会大大改善肿瘤的诊断。随着技术的发展，价格将会成为液体活检在肿瘤早筛早诊领域考量的重要杠杆。从这次COVID-19疫情中，我们获得的一个明显教训是，即使在高收入国家，大规模检测也可以迅速加剧卫生系统中现有的资金不足。考虑到全球范围内癌症数量的快速增长，类似问题的考虑对癌症也尤为重要。对于政府、保险公司，甚至是检测服务公司来说，必须要清晰了解通过早期发现和治疗癌症而获得的长期资金节省的理由，以及相应的液体活检检测能否具有适用于大规模人群的成本效益。相信技术研发的发展，对所有人都进行癌症液体活检会成为可能。
参考文献
【1】Global liquid biopsy market will reach USD 12,062 million by 2025: Zion Market Research [news relsease]. New York, NY; Zion Market Research. May 14, 2019.
【2】Liquid Cancer Biopsy: The Future of Cancer Detection?Lancet Oncol. 2016 Feb;17(2):123. < DOI: 10.1016/S1470-2045(16)00016-4.>
【3】Cancer Detection: The Quest for a Single Liquid Biopsy for All.Lancet Oncol. 2020 Jun;21(6):733.
【4】M.C. Liu, G.R. Oxnard ,E.A. Klein, et al.Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA.Annals of Oncology.VOLUME 31, ISSUE 6, P745-759, JUNE 01, 2020
【5】Anne Marie Lennon , Adam H Buchanan , Isaac Kinde, et al. Feasibility of blood testing combined with PET-CT to screen for cancer and guide intervention.Science. 2020 Apr 28;eabb9601.
