支链氨基酸（BCAA）包括亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸，可作为能量来源以及重要营养素和代谢信号的调控因子。研究数据表明， BCAA代谢异常与心血管疾病风险相关；血小板在心血管疾病中发挥重要作用，但BCAA代谢与血小板之间的关系尚不清楚。上海交通大学刘俊岭和孙海鹏团队通过检测健康受试者摄入BCAA前后血小板活性，以及使用蛋白磷酸酶2Cm（PP2Cm）缺陷小鼠阐明BCAA代谢对血小板活化和血栓形成的影响，揭示BCAA代谢对维持血小板活化具有重要调控作用，相关研究成果发表于《Circulation》。
研究路线
BCAA代谢促进血小板活性和动脉血栓形成
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摄入BCAA增强人体血小板活性
将健康志愿者进行禁食过夜，并在摄入BCAA之前口服0.9％NaCl。摄入BCAA之前（0小时）和之后制备血小板。通过靶向代谢组学检测人血小板中的BCAA水平。结果发现，摄入后1小时，血小板中Val，Leu和Ile的水平达到峰值。摄入BCAA显著促进人血小板聚集，并且摄入后1小时，BCAA的促进作用达到峰值，P-选择素暴露在人血小板中的水平增加。因此，摄入BCAAs可显著促进人血小板的聚集和脱颗粒。BCAA的摄入显著增强激动剂PAC1与人血小板的结合，增强人体在Fg(固定化纤维蛋白原)上的血小板扩散，
同时BCAA也能调节整合素αIIbβ3介导的血小板活化。（图1 A-G） 2
BCAA分解代谢缺陷抑制血小板活性
BCKD是BCAA分解代谢的限速酶。其活性受BCKD激酶（BCKDK）和蛋白磷酸酶2Cm（PP2Cm）的调控。其中 PP2Cm使BCKD去磷酸化，从而增强BCAA分解代谢。PP2Cm缺乏导致BCAA分解代谢缺陷。在激动剂作用下，测量PP2Cm缺陷（PP2Cm-/-）小鼠和WT小鼠的血小板聚集，与野生型血小板相比，PP2Cm-/-小鼠血小板活性降低，因此，BCAA代谢缺陷抑制血小板活化。（图2 A-H）
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BCAA分解代谢缺陷抑制动脉血栓形成
激光诱导的提睾肌微动脉损伤模型结果显示，与0.9％NaCl处理的WT小鼠相比，BCAA处理的WT小鼠的血小板积聚增加；与0.9％NaCl处理的WT小鼠相比，0.9％NaCl处理的PP2Cm-/-小鼠的血小板积聚显著降低。因此，BCAA代谢促进体内微动脉血栓形成。氯化铁诱导的颈动脉血栓形成模型结果显示，与0.9％NaCl处理的WT小鼠相比，BCAA处理的WT小鼠平均血流阻塞时间显著减少，表明摄入BCAA促进体内动脉血栓形成。下腔静脉（IVC）结扎模型结果显示，其平均血栓长度和重量均无显著差异。因此，摄入BCAA和BCAA分解代谢不影响静脉血栓形成。小鼠尾出血实验结果显示，其尾出血时间均无显著差异。因此，
BCAA分解代谢对止血无影响。（图3 A-G）
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BCAA分解产物丙酰辅酶A增强血小板活性
BCAA处理的人血小板和小鼠PP2Cm-/-血小板中的ATP水平，发现能量释放不是BCAA促进血小板活化的主要原因。检测Leu，Ile，Val及其各自的酮酸代谢物KIC，KMV和KIV对血小板活化的影响，发现其酮酸代谢物KIV＞KMV＞KIC可以不同程度增强激动剂诱导的血小板聚集、p选择素暴露、PAC1结合和ATP分泌。上述结果表明，Val/KIV和Ile/KMV分解代谢在BCAA介导的血小板活化中发挥更重要作用。在BCAA分解代谢途径中，Leu分解代谢最终导致乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A的形成，Val被代谢成丙酰辅酶A，Ile被代谢成乙酰辅酶A和丙酰辅酶A。可见丙酰辅酶A是KIV和KMV氧化的共同终产物，因此有必要测试丙酰辅酶A对血小板活化的影响，丙酰辅酶A剂量依赖性地增强血小板聚集、p选择素暴露、PAC1结合和ATP分泌。此外，丙酰辅酶A对PP2Cm-/-和WT小鼠对血小板的聚集水平相当。由此表明，丙酰辅酶A是Val/KIV和Ile/KMV代谢通路介导血小板活化的关键介质（图4 A-L）。
BCAA分解代谢诱导血小板TMOD3丙酰化
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BCAA代谢促进血小板TMOD3丙酰化
赖氨酸残基（Kpr）的丙酰化最近已成为哺乳动物细胞中一种重要的可逆PTM，结果发现，BCAAs剂量依赖性地增加人血小板中的蛋白丙酰化。与野生型血小板相比，PP2Cm-/-血小板中蛋白丙酰化的水平降低。免疫沉淀和质谱鉴定结果表明，大多数丙酰化蛋白是细胞骨架蛋白，如tropomodulin-3(TMOD3), PDM1L1等；其中，仅TMOD3丙酰化在人血小板中呈BCAA剂量依赖性模式。因此，TMOD3丙酰化参与αIIbβ3介导的血小板活化。（图5 A-I）
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K255位的TMOD3丙酰化参与整合素αIIbβ3介导的细胞扩散
蛋白质谱鉴定出TMOD3丙酰化位点位于K255，K255突变为丙氨酸后，完全消除了HEK293T细胞中TMOD3的丙酰化作用，细胞扩散显著降低。因此，K255是TMOD3丙酰化的重要位点，并且在细胞扩散中起关键作用。（图6 A-G）
MS中BCAA代谢功能紊乱与血小板过度活化有关
MS（代谢综合征）是心血管疾病的关键危险因素，T2DM是一种典型的MS。本研究发现，与健康对照组相比，T2DM患者的血小板活性增加（图7A-B），且T2DM患者的血小板中BCAAs的水平升高（图7C-E），血小板中BCAA分解代谢正调控因子表达也增加，特别是PP2Cm的表达增加，表明BCAA分解代谢与T2DM患者的血小板过度活化和血栓形成风险相关（图7F）。瘦素缺陷型ob / ob小鼠常用于模拟人MS和T2DM。与野生型小鼠相比，在低蛋白饮食下，补充BCAA的ob / ob小鼠中的血小板活性显著提高（图7G-H），降低饮食中BCAA的摄入可以降低ob/ob小鼠的血小板活性。这些结果提示，BCAA的水平升高与MS中血小板过度活化密切相关。（图7 A-H）
小结
BCAA通常用于健身和专业运动。临床上，注射BCAA还用于治疗急性、亚急性、慢性重型肝炎、肝硬化和肝性脑病等。尽管BCAA具有这些益处，本研究揭示了摄入BCAA会促进血小板活化并增加血栓形成风险的新机制，提示摄入BCAA对患有心血管疾病的个体可能有害。Val和Ile的酮酸代谢物KIV和KMV，有着共同的代谢终物丙酰辅酶A可显著增强血小板的活化，表明Val和Ile代谢途径是调节血小板活化的主要途径。本研究发现经BCAAs处理的血小板中，TMOD3发生了丙酰化，而K255位点TMOD3丙酰化水平的升高在促进血小板活化中发挥了重要作用，揭示了蛋白丙酰化和BCAA分解代谢的新功能。同时，以BCAA分解代谢途径为靶点或降低饮食中BCAA的摄入量可作为与代谢综合征相关的血栓形成的新型治疗策略。
配套检测方法
本研究中涉及的支链氨基酸、酮酸代谢物及辅酶等小分子物质，麦特绘谱均可提供全套解决方案！其中Leucine、Isoleucine、Valine、α-Ketoisocaproic acid、α-Keto-β-methylvaleric acid、α-Ketoisovaleric acid为支链氨基酸相关代谢绝对定量检测方法；辅酶A、丁酰辅酶A、丙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、琥珀酰辅酶A等为辅酶类绝对定量检测方法。
参考文献
Xu Y., et al., Branched-Chain Amino Acid Catabolism Promotes Thrombosis Risk by Enhancing Tropomodulin-3 Propionylation in Platelets. 2020 doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.119.043581.
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