支鏈氨基酸（BCAA）包括亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸，可作為能量來源以及重要營養素和代謝信號的調控因子。研究數據表明， BCAA代謝異常與心血管疾病風險相關；血小板在心血管疾病中發揮重要作用，但BCAA代謝與血小板之間的關係尚不清楚。上海交通大學劉俊嶺和孫海鵬團隊通過檢測健康受試者攝入BCAA前後血小板活性，以及使用蛋白磷酸酶2Cm（PP2Cm）缺陷小鼠闡明BCAA代謝對血小板活化和血栓形成的影響，揭示BCAA代謝對維持血小板活化具有重要調控作用，相關研究成果發表於《Circulation》。
研究路線
BCAA代謝促進血小板活性和動脈血栓形成
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攝入BCAA增強人體血小板活性
將健康志願者進行禁食過夜，並在攝入BCAA之前口服0.9％NaCl。攝入BCAA之前（0小時）和之後製備血小板。通過靶向代謝組學檢測人血小板中的BCAA水平。結果發現，攝入後1小時，血小板中Val，Leu和Ile的水平達到峰值。攝入BCAA顯著促進人血小板聚集，並且攝入後1小時，BCAA的促進作用達到峰值，P-選擇素暴露在人血小板中的水平增加。因此，攝入BCAAs可顯著促進人血小板的聚集和脫顆粒。BCAA的攝入顯著增強激動劑PAC1與人血小板的結合，增強人體在Fg(固定化纖維蛋白原)上的血小板擴散，
同時BCAA也能調節整合素αIIbβ3介導的血小板活化。（圖1 A-G） 2
BCAA分解代謝缺陷抑制血小板活性
BCKD是BCAA分解代謝的限速酶。其活性受BCKD激酶（BCKDK）和蛋白磷酸酶2Cm（PP2Cm）的調控。其中 PP2Cm使BCKD去磷酸化，從而增強BCAA分解代謝。PP2Cm缺乏導致BCAA分解代謝缺陷。在激動劑作用下，測量PP2Cm缺陷（PP2Cm-/-）小鼠和WT小鼠的血小板聚集，與野生型血小板相比，PP2Cm-/-小鼠血小板活性降低，因此，BCAA代謝缺陷抑制血小板活化。（圖2 A-H）
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BCAA分解代謝缺陷抑制動脈血栓形成
激光誘導的提睪肌微動脈損傷模型結果顯示，與0.9％NaCl處理的WT小鼠相比，BCAA處理的WT小鼠的血小板積聚增加；與0.9％NaCl處理的WT小鼠相比，0.9％NaCl處理的PP2Cm-/-小鼠的血小板積聚顯著降低。因此，BCAA代謝促進體內微動脈血栓形成。氯化鐵誘導的頸動脈血栓形成模型結果顯示，與0.9％NaCl處理的WT小鼠相比，BCAA處理的WT小鼠平均血流阻塞時間顯著減少，表明攝入BCAA促進體內動脈血栓形成。下腔靜脈（IVC）結紮模型結果顯示，其平均血栓長度和重量均無顯著差異。因此，攝入BCAA和BCAA分解代謝不影響靜脈血栓形成。小鼠尾出血實驗結果顯示，其尾出血時間均無顯著差異。因此，
BCAA分解代謝對止血無影響。（圖3 A-G）
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BCAA分解產物丙酰輔酶A增強血小板活性
BCAA處理的人血小板和小鼠PP2Cm-/-血小板中的ATP水平，發現能量釋放不是BCAA促進血小板活化的主要原因。檢測Leu，Ile，Val及其各自的酮酸代謝物KIC，KMV和KIV對血小板活化的影響，發現其酮酸代謝物KIV＞KMV＞KIC可以不同程度增強激動劑誘導的血小板聚集、p選擇素暴露、PAC1結合和ATP分泌。上述結果表明，Val/KIV和Ile/KMV分解代謝在BCAA介導的血小板活化中發揮更重要作用。在BCAA分解代謝途徑中，Leu分解代謝最終導致乙酰乙酰輔酶A和乙酰輔酶A的形成，Val被代謝成丙酰輔酶A，Ile被代謝成乙酰輔酶A和丙酰輔酶A。可見丙酰輔酶A是KIV和KMV氧化的共同終產物，因此有必要測試丙酰輔酶A對血小板活化的影響，丙酰輔酶A劑量依賴性地增強血小板聚集、p選擇素暴露、PAC1結合和ATP分泌。此外，丙酰輔酶A對PP2Cm-/-和WT小鼠對血小板的聚集水平相當。由此表明，丙酰輔酶A是Val/KIV和Ile/KMV代謝通路介導血小板活化的關鍵介質（圖4 A-L）。
BCAA分解代謝誘導血小板TMOD3丙酰化
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BCAA代謝促進血小板TMOD3丙酰化
賴氨酸殘基（Kpr）的丙酰化最近已成為哺乳動物細胞中一種重要的可逆PTM，結果發現，BCAAs劑量依賴性地增加人血小板中的蛋白丙酰化。與野生型血小板相比，PP2Cm-/-血小板中蛋白丙酰化的水平降低。免疫沉澱和質譜鑑定結果表明，大多數丙酰化蛋白是細胞骨架蛋白，如tropomodulin-3(TMOD3), PDM1L1等；其中，僅TMOD3丙酰化在人血小板中呈BCAA劑量依賴性模式。因此，TMOD3丙酰化參與αIIbβ3介導的血小板活化。（圖5 A-I）
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K255位的TMOD3丙酰化參與整合素αIIbβ3介導的細胞擴散
蛋白質譜鑑定出TMOD3丙酰化位點位於K255，K255突變為丙氨酸後，完全消除了HEK293T細胞中TMOD3的丙酰化作用，細胞擴散顯著降低。因此，K255是TMOD3丙酰化的重要位點，並且在細胞擴散中起關鍵作用。（圖6 A-G）
MS中BCAA代謝功能紊亂與血小板過度活化有關
MS（代謝綜合徵）是心血管疾病的關鍵危險因素，T2DM是一種典型的MS。本研究發現，與健康對照組相比，T2DM患者的血小板活性增加（圖7A-B），且T2DM患者的血小板中BCAAs的水平升高（圖7C-E），血小板中BCAA分解代謝正調控因子表達也增加，特別是PP2Cm的表達增加，表明BCAA分解代謝與T2DM患者的血小板過度活化和血栓形成風險相關（圖7F）。瘦素缺陷型ob / ob小鼠常用於模擬人MS和T2DM。與野生型小鼠相比，在低蛋白飲食下，補充BCAA的ob / ob小鼠中的血小板活性顯著提高（圖7G-H），降低飲食中BCAA的攝入可以降低ob/ob小鼠的血小板活性。這些結果提示，BCAA的水平升高與MS中血小板過度活化密切相關。（圖7 A-H）
小結
BCAA通常用於健身和專業運動。臨床上，注射BCAA還用於治療急性、亞急性、慢性重型肝炎、肝硬化和肝性腦病等。儘管BCAA具有這些益處，本研究揭示了攝入BCAA會促進血小板活化並增加血栓形成風險的新機制，提示攝入BCAA對患有心血管疾病的個體可能有害。Val和Ile的酮酸代謝物KIV和KMV，有著共同的代謝終物丙酰輔酶A可顯著增強血小板的活化，表明Val和Ile代謝途徑是調節血小板活化的主要途徑。本研究發現經BCAAs處理的血小板中，TMOD3發生了丙酰化，而K255位點TMOD3丙酰化水平的升高在促進血小板活化中發揮了重要作用，揭示了蛋白丙酰化和BCAA分解代謝的新功能。同時，以BCAA分解代謝途徑為靶點或降低飲食中BCAA的攝入量可作為與代謝綜合徵相關的血栓形成的新型治療策略。
配套檢測方法
本研究中涉及的支鏈氨基酸、酮酸代謝物及輔酶等小分子物質，麥特繪譜均可提供全套解決方案！其中Leucine、Isoleucine、Valine、α-Ketoisocaproic acid、α-Keto-β-methylvaleric acid、α-Ketoisovaleric acid為支鏈氨基酸相關代謝絕對定量檢測方法；輔酶A、丁酰輔酶A、丙酰輔酶A、丙二酰輔酶A、琥珀酰輔酶A等為輔酶類絕對定量檢測方法。
參考文獻
Xu Y., et al., Branched-Chain Amino Acid Catabolism Promotes Thrombosis Risk by Enhancing Tropomodulin-3 Propionylation in Platelets. 2020 doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.119.043581.
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