杨朝勇教授团队和马余强教授团队合作设计了一种流体多价纳米界面，用适体功能化的白细胞膜纳米囊泡装饰微流控芯片，该芯片实现了从17/17例癌症患者血液样本中高效、高特异性和高生存能力地分离CTCs。相关成果发表在 J. Am. Chem. Soc.上。（DOI: 10.1021/jacs.9b13782）
循环肿瘤细胞（CTCs）是临床癌症诊断和个体化治疗中重要的"液体活检"靶点之一。CTCs分离常通过配体的特异性识别作用实现。现有的纳米界面一般依赖于固定在固体基质上的识别配体，通过多价结合增强界面对CTCs的亲和力。但仍存在亲和力增强有限、细胞界面相互作用的非选择性增强和目标细胞的碰撞损伤等缺点。
作者设计了一种用于高效分离CTCs的流体适体功能化的软和高亲和力纳米界面微流控芯片（FLASH-Chip）。芯片利用多尺度集成，将仿生纳米膜与微流体相结合，促进CTC-界面间的相互作用（Figure 1B）。采用自顶向下策略将生物素化的B-白细胞膜碎片通过聚碳酸酯多孔膜制成L-纳米囊泡（Figure 2A）。选择与CTCs的生物标记物（上皮细胞黏附分子（EpCAM））特异性结合的SYL3C适体（Apt）作为识别配体，用Apt-端胆固醇（Apt-Chol）对L-纳米囊泡进行修饰，制备出功能化的L-纳米囊泡（Figure 2B）。此外，确定性横向位移（DLD）模式的微阵列微流控芯片（DLD-Chip）作为捕获平台（Figure 1A），Apt-纳米囊泡通过生物素-链霉亲和素（SA）反应组装到芯片上，该微型器件能选择性增加CTCs对捕获界面的碰撞频率，减少血细胞吸附和细胞损伤，高效率和高纯度地捕获CTCs。
L-纳米囊泡的水动力直径为229.2±2.9 nm，多分散性指数（PDI）低至0.1，表明其具有良好的单分散性（Figure 2C）。透射电镜（TEM）图像显示，Apt-纳米囊泡维持了生物膜的磷脂双层结构，尺寸为86.0±27.0 nm（Figure 2D）。Apt-纳米囊泡与EpCAM-阳性的SW480肿瘤细胞有选择性地结合，而与血细胞不结合（Figure 2E）。
Figure 1. A.FLASH芯片制作原理图。a.芯片外观 b.芯片中肿瘤细胞和血细胞沿DLD模型的运动路径 c.纳米囊泡覆盖的微柱界面 d.生物素-链霉亲和素反应组装纳米囊泡到芯片的原理图 B.流体多价结合在仿生膜纳米界面上的工作原理图（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
Figure 2.Apt-纳米囊泡的表征。A.制备Apt-纳米囊泡的原理图 a.白细胞膜与脂质的生物素化作用（DSPE-PEG-biotin） b. B-白细胞膜碎片通过聚碳酸酯多孔膜形成L-纳米囊泡 c.应用Apt-Chol对L-纳米囊泡进行修饰 B.适体和Apt-Chol与L-纳米囊泡共孵育的相对荧光强度 C.Apt-纳米囊泡的水动力直径和PDI值 D.Apt-纳米囊泡的TEM图像 E.多价Apt-纳米囊泡、单价SYL3C适体和随机序列（RS）在SW480细胞和血细胞中的荧光强度（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
作者提出了一种流动性增强的多价结合策略，利用纳米囊泡作为支架，动态调节适体的局部密度，以提高Apt-纳米囊泡对SW480细胞的结合亲和力。Apt-纳米囊泡对SW480细胞的解离常数（K）为3.66 + 0.34 pM，比单价SYL3C适体（K = 142.50 + 20.55 nM）高约3.9万倍（Figure 3A and 3B）。Apt-纳米囊泡的结合亲和力约为Apt-AuNPs的29倍（Figure 3C）。固定化的Apt-纳米囊泡其亲和力降低约8倍（Figure 3D），可能是由于固定化Apt-纳米囊泡（纳米膜与戊二醛预交联）使其流动性减弱造成的。
Figure 3.单价适体与不同多价适体支架的亲和力评估。A.单价适体纳米囊泡 B.多价适体纳米囊泡 C.Apt-AuNPs和 D.固定化的Apt-纳米囊泡对SW480细胞的解离常数（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
作者研究了FLASH芯片对肿瘤细胞的捕获性能。荧光染料标记的SA和抗CD45抗体检测到仿生纳米囊泡的成功合成（Figure 4A）。荧光标记的肿瘤细胞悬浮于缓冲液中，以0.35 mL/h的流速将100个细胞注入芯片，FLASH芯片对SW480细胞的捕获效率高达91.2 %，而Apt芯片只有50.5 %。FLASH芯片对其他肿瘤细胞（MCF-7、HCT 116、LNCaP）的捕获效率为84.3 %-91.3 %（Figure 4E）。固定化纳米囊泡的FLASH芯片捕获HCT116的效率从82.1 %下降到63.5 %（p < 0.001，Figure 4F）。进一步探索FLASH芯片的临床应用的潜力，人工临床标本由失效肿瘤细胞放入健康志愿者的全血中制备。 FLASH芯片对不同肿瘤细胞的捕获效率均在70 %以上，而Apt芯片只能捕获约10 %的肿瘤细胞（Figure 4G）。
Figure 4.FLASH芯片的捕获性能。A.荧光显微成像 B.FLASH芯片的SEM成像和 C.外层纳米界面 D.FLASH芯片纳米界面的的AFM图像 E. SA芯片、Apt芯片、RS-FLASH芯片和 FLASH芯片对肿瘤细胞（SW480、MCF-7、HCT 116和LNCaP）的捕获能力 F.FLASH芯片与交联固定的FLASH芯片的捕获效率比较（p< 0.001） G.Apt芯片或FLASH芯片在全血中捕获罕见肿瘤细胞（约20或100个肿瘤细胞）的效率（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
作者进一步研究了FLASH芯片的特异性吸附性能和其捕获的肿瘤细胞的存活率。有报道称白细胞膜制备的纳米颗粒可以降低其对血细胞的非特异性吸附。作者以人类Ramos细胞为模型白细胞，检测到106个Ramos细胞只有260个残留在FLASH芯片中（Figure 5A and 5B），证实了仿生纳米囊泡具有显著的抵抗血细胞吸附能力。FLASH芯片捕获的肿瘤细胞的存活率保持在97.6 %，显著高于Apt芯片（p < 0.001，Figure 5C）。
Figure 5.仿生纳米界面的抗血细胞能力和细胞生物相容性。A.不同芯片非特异性捕获Ramos细胞的荧光显微图像 B.不同芯片中残留的Ramos细胞数量 C.肿瘤细胞在缓冲液中的细胞存活率，用FLASH芯片或Apt芯片捕获（p <0.001）（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
为评价FLASH芯片临床应用的可行性，作者用FLASH芯片检测了17例癌症患者和5例健康志愿者的血样。捕获的细胞通过免疫细胞化学鉴定，只有Hoechst 33342阳性、CK阳性和CD45阴性的细胞被认为是CTCs，而细胞有CD45表达而无CK表达的被认为是WBCs（白细胞）（Figure 6D）。所有癌症患者均成功检测到CTCs，而健康对照组中未检测到CTCs（Figure 6A）。比较Apt芯片和FLASH芯片的性能。使用FLASH芯片成功检测到患者样本中CTCs，而Apt芯片未能检测到成功（Figure 6B）。FLASH芯片上残留的WBCs比Apt芯片上的少一半，即背景细胞的非特异性吸附要少得多（Figure 6C）。这些结果表明了仿生纳米界面在高效、特异性捕获CTCs方面的优越性，显示了多价流体仿生纳米界面的临床应用潜力。
Figure 6.用FLASH芯片检测癌症患者的CTCs。A. 1 mL患者和健康对照组的血液样本中CTCs的含量。中间的水平线表示CTCs数目的中位数:健康组为0、癌症病人组为6 B.分别使用FLASH芯片和Apt芯片检测1 mL癌症患者血液中CTCs的数量 C.FLASH芯片与Apt芯片的剩余WBC比值 D.6号病人的CTCs和WBCs残留的代表性显微照片（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
总结：杨朝勇教授团队和南京大学马余强教授团队合作设计了一种流体多价纳米界面，将界面亲和力提高了4个数量级。同时，该纳米界面继承了白细胞膜的结构和功能，减少了血细胞吸附和细胞损伤。以此为基础设计的芯片实现了从17/17例癌症患者血液样本中高效、高特异性和高生存能力地分离CTCs，显示了多价流体仿生纳米界面的临床应用潜力。本研究利用天然生物材料与细胞间的相互作用，为生物医学领域的纳米生物界面设计提供了新的思路。
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