楊朝勇教授團隊和馬餘強教授團隊合作設計了一種流體多價納米界面，用適體功能化的白細胞膜納米囊泡裝飾微流控芯片，該芯片實現了從17/17例癌症患者血液樣本中高效、高特異性和高生存能力地分離CTCs。相關成果發表在 J. Am. Chem. Soc.上。（DOI: 10.1021/jacs.9b13782）
循環腫瘤細胞（CTCs）是臨床癌症診斷和個體化治療中重要的"液體活檢"靶點之一。CTCs分離常通過配體的特異性識別作用實現。現有的納米界面一般依賴於固定在固體基質上的識別配體，通過多價結合增強界面對CTCs的親和力。但仍存在親和力增強有限、細胞界面相互作用的非選擇性增強和目標細胞的碰撞損傷等缺點。
作者設計了一種用於高效分離CTCs的流體適體功能化的軟和高親和力納米界面微流控芯片（FLASH-Chip）。芯片利用多尺度集成，將仿生納米膜與微流體相結合，促進CTC-界面間的相互作用（Figure 1B）。採用自頂向下策略將生物素化的B-白細胞膜碎片通過聚碳酸酯多孔膜製成L-納米囊泡（Figure 2A）。選擇與CTCs的生物標記物（上皮細胞黏附分子（EpCAM））特異性結合的SYL3C適體（Apt）作為識別配體，用Apt-端膽固醇（Apt-Chol）對L-納米囊泡進行修飾，製備出功能化的L-納米囊泡（Figure 2B）。此外，確定性橫向位移（DLD）模式的微陣列微流控芯片（DLD-Chip）作為捕獲平臺（Figure 1A），Apt-納米囊泡通過生物素-鏈黴親和素（SA）反應組裝到芯片上，該微型器件能選擇性增加CTCs對捕獲界面的碰撞頻率，減少血細胞吸附和細胞損傷，高效率和高純度地捕獲CTCs。
L-納米囊泡的水動力直徑為229.2±2.9 nm，多分散性指數（PDI）低至0.1，表明其具有良好的單分散性（Figure 2C）。透射電鏡（TEM）圖像顯示，Apt-納米囊泡維持了生物膜的磷脂雙層結構，尺寸為86.0±27.0 nm（Figure 2D）。Apt-納米囊泡與EpCAM-陽性的SW480腫瘤細胞有選擇性地結合，而與血細胞不結合（Figure 2E）。
Figure 1. A.FLASH芯片製作原理圖。a.芯片外觀 b.芯片中腫瘤細胞和血細胞沿DLD模型的運動路徑 c.納米囊泡覆蓋的微柱界面 d.生物素-鏈黴親和素反應組裝納米囊泡到芯片的原理圖 B.流體多價結合在仿生膜納米界面上的工作原理圖（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
Figure 2.Apt-納米囊泡的表徵。A.製備Apt-納米囊泡的原理圖 a.白細胞膜與脂質的生物素化作用（DSPE-PEG-biotin） b. B-白細胞膜碎片通過聚碳酸酯多孔膜形成L-納米囊泡 c.應用Apt-Chol對L-納米囊泡進行修飾 B.適體和Apt-Chol與L-納米囊泡共孵育的相對熒光強度 C.Apt-納米囊泡的水動力直徑和PDI值 D.Apt-納米囊泡的TEM圖像 E.多價Apt-納米囊泡、單價SYL3C適體和隨機序列（RS）在SW480細胞和血細胞中的熒光強度（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
作者提出了一種流動性增強的多價結合策略，利用納米囊泡作為支架，動態調節適體的局部密度，以提高Apt-納米囊泡對SW480細胞的結合親和力。Apt-納米囊泡對SW480細胞的解離常數（K）為3.66 + 0.34 pM，比單價SYL3C適體（K = 142.50 + 20.55 nM）高約3.9萬倍（Figure 3A and 3B）。Apt-納米囊泡的結合親和力約為Apt-AuNPs的29倍（Figure 3C）。固定化的Apt-納米囊泡其親和力降低約8倍（Figure 3D），可能是由於固定化Apt-納米囊泡（納米膜與戊二醛預交聯）使其流動性減弱造成的。
Figure 3.單價適體與不同多價適體支架的親和力評估。A.單價適體納米囊泡 B.多價適體納米囊泡 C.Apt-AuNPs和 D.固定化的Apt-納米囊泡對SW480細胞的解離常數（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
作者研究了FLASH芯片對腫瘤細胞的捕獲性能。熒光染料標記的SA和抗CD45抗體檢測到仿生納米囊泡的成功合成（Figure 4A）。熒光標記的腫瘤細胞懸浮於緩衝液中，以0.35 mL/h的流速將100個細胞注入芯片，FLASH芯片對SW480細胞的捕獲效率高達91.2 %，而Apt芯片只有50.5 %。FLASH芯片對其他腫瘤細胞（MCF-7、HCT 116、LNCaP）的捕獲效率為84.3 %-91.3 %（Figure 4E）。固定化納米囊泡的FLASH芯片捕獲HCT116的效率從82.1 %下降到63.5 %（p < 0.001，Figure 4F）。進一步探索FLASH芯片的臨床應用的潛力，人工臨床標本由失效腫瘤細胞放入健康志願者的全血中製備。 FLASH芯片對不同腫瘤細胞的捕獲效率均在70 %以上，而Apt芯片只能捕獲約10 %的腫瘤細胞（Figure 4G）。
Figure 4.FLASH芯片的捕獲性能。A.熒光顯微成像 B.FLASH芯片的SEM成像和 C.外層納米界面 D.FLASH芯片納米界面的的AFM圖像 E. SA芯片、Apt芯片、RS-FLASH芯片和 FLASH芯片對腫瘤細胞（SW480、MCF-7、HCT 116和LNCaP）的捕獲能力 F.FLASH芯片與交聯固定的FLASH芯片的捕獲效率比較（p< 0.001） G.Apt芯片或FLASH芯片在全血中捕獲罕見腫瘤細胞（約20或100個腫瘤細胞）的效率（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
作者進一步研究了FLASH芯片的特異性吸附性能和其捕獲的腫瘤細胞的存活率。有報道稱白細胞膜製備的納米顆粒可以降低其對血細胞的非特異性吸附。作者以人類Ramos細胞為模型白細胞，檢測到106個Ramos細胞只有260個殘留在FLASH芯片中（Figure 5A and 5B），證實了仿生納米囊泡具有顯著的抵抗血細胞吸附能力。FLASH芯片捕獲的腫瘤細胞的存活率保持在97.6 %，顯著高於Apt芯片（p < 0.001，Figure 5C）。
Figure 5.仿生納米界面的抗血細胞能力和細胞生物相容性。A.不同芯片非特異性捕獲Ramos細胞的熒光顯微圖像 B.不同芯片中殘留的Ramos細胞數量 C.腫瘤細胞在緩衝液中的細胞存活率，用FLASH芯片或Apt芯片捕獲（p <0.001）（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
為評價FLASH芯片臨床應用的可行性，作者用FLASH芯片檢測了17例癌症患者和5例健康志願者的血樣。捕獲的細胞通過免疫細胞化學鑑定，只有Hoechst 33342陽性、CK陽性和CD45陰性的細胞被認為是CTCs，而細胞有CD45表達而無CK表達的被認為是WBCs（白細胞）（Figure 6D）。所有癌症患者均成功檢測到CTCs，而健康對照組中未檢測到CTCs（Figure 6A）。比較Apt芯片和FLASH芯片的性能。使用FLASH芯片成功檢測到患者樣本中CTCs，而Apt芯片未能檢測到成功（Figure 6B）。FLASH芯片上殘留的WBCs比Apt芯片上的少一半，即背景細胞的非特異性吸附要少得多（Figure 6C）。這些結果表明了仿生納米界面在高效、特異性捕獲CTCs方面的優越性，顯示了多價流體仿生納米界面的臨床應用潛力。
Figure 6.用FLASH芯片檢測癌症患者的CTCs。A. 1 mL患者和健康對照組的血液樣本中CTCs的含量。中間的水平線表示CTCs數目的中位數:健康組為0、癌症病人組為6 B.分別使用FLASH芯片和Apt芯片檢測1 mL癌症患者血液中CTCs的數量 C.FLASH芯片與Apt芯片的剩餘WBC比值 D.6號病人的CTCs和WBCs殘留的代表性顯微照片（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
總結：楊朝勇教授團隊和南京大學馬餘強教授團隊合作設計了一種流體多價納米界面，將界面親和力提高了4個數量級。同時，該納米界面繼承了白細胞膜的結構和功能，減少了血細胞吸附和細胞損傷。以此為基礎設計的芯片實現了從17/17例癌症患者血液樣本中高效、高特異性和高生存能力地分離CTCs，顯示了多價流體仿生納米界面的臨床應用潛力。本研究利用天然生物材料與細胞間的相互作用，為生物醫學領域的納米生物界面設計提供了新的思路。
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