CELL：髓母细胞瘤形成的秘密

北儿神外周刊

第29 期

神外前沿讯，1月23日，国际顶级学术期刊CELL（IF：36.216）发表了一篇关于髓母细胞瘤形成与生长机制研究的文章。

美国维吉尼亚大学Maojin Yao等研究人员的最新研究表明，星形胶质细胞的转分化实现了髓母细胞瘤肿瘤生长所需的多细胞旁分泌反馈回路，

神外前沿-北儿神外周刊在第一时间进行了要点编译，并由北京儿童医院神经外科主任葛明教授对编译稿件学术审稿。

编译全文

星形胶质细胞的转分化实现了髓母细胞瘤生长所需的多细胞旁分泌反馈回路

Astrocytic trans-Differentiation Completes a Multicellular Paracrine Feedback Loop Required for Medulloblastoma Tumor Growth

DOI: 10.1016/j.cell.2019.12.024

Source: https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31386-8

摘要

肿瘤微环境（TME）对于肿瘤进展至关重要。然而，由于其复杂的细胞成分，TME的建立和作用仍然不清楚。通过使用称为双标记镶嵌分析（MADM）的小鼠遗传系统，研究人员描述了在SHH（sonic hedgehog）亚型髓母细胞瘤（起源于大脑中的单潜能颗粒神经元祖细胞）中，单细胞分辨率下TME的演化。首先，研究人员发现TME中的星形胶质细胞（TuAstrocytes）是从肿瘤颗粒神经元前体细胞（GNP）转分化而来的，它们正常情况下不会分化为星形胶质细胞。其次，研究人员发现TME产生的IGF1促进肿瘤进展。第三，研究人员发现胰岛素样生长因子1（IGF1）是由肿瘤相关的小胶质细胞受白介-4（IL-4）刺激后产生的。最后，研究人员发现IL-4是由TME中的星形胶质细胞分泌的。总的来说，这项研究揭示了在髓母细胞瘤TME内产生多边网络的演变过程：一部分肿瘤细胞转分化为肿瘤微环境中的星形胶质细胞，而后者又产生IL-4，刺激小胶质细胞产生IGF1，从而促进肿瘤进展。

肿瘤就像一个过度活跃器官。肿瘤细胞与肿瘤微环境以多种复杂方式相互作用以维持其生存首先，肿瘤微环境由多种细胞类型组成，包括血管成分，免疫细胞、以及其他组织原位细胞。其次，肿瘤微环境内的细胞间相互作用，形成肿瘤细胞赖以生存的环境。最后，肿瘤微环境与肿瘤细胞从最初到进展甚至完全恶性的过程呈动态一致发展。肿瘤微环境甚至可以在治疗过程中重组，从而导致治疗耐受。因此，解开肿瘤微环境的复杂性是势在必行的：肿瘤微环境是如何建立以及多相复杂的肿瘤微环境中的细胞成分是如何相互作用导致肿瘤细胞进展。

实验室人员采用了一种称为双标记镶嵌分析（MADMs）的小鼠遗传系统。MADMs利用Cre-loxP基因重组技术在杂合子小鼠中诱导染色体间有丝分裂重组产生少量绿色荧光蛋白（GFP）标记的细胞而此种细胞特定的肿瘤抑制基因（TSG）纯合缺失，以及在体细胞中产生红色荧光蛋白标记的野生型同种细胞。仔细筛选出肿瘤中表达但不在TME细胞中特异性表达的Cre基因，研究人员能够从肿瘤最初发生到完全恶化的整个过程中研究GFP标记的肿瘤细胞与未受标记的TME细胞的募集，激活和组织网络之间关系。

髓母细胞瘤是最常见的小儿脑恶性肿瘤，常见于发育中小脑，而SHH亚型髓母细胞瘤通常包含多种 TME细胞类型包括神经元，内皮细胞，小胶质细胞-巨噬细胞和星形胶质细胞。尽管髓母细胞肿瘤细胞在体内能进行无法控制地增殖，但很难使其在体外增殖，而是需要在免疫缺陷小鼠的脑中进行连续移植，来扩增髓母细胞肿瘤细胞。对于这一明显矛盾的解释可能是由于髓母细胞肿瘤细胞需要TME细胞信号赖以生存，而这在体外是缺乏的。

尽管髓母细胞瘤中星形胶质细胞成分起源尚不明确但却是不良预后的相关因素。髓母细胞瘤肿瘤细胞起源于颗粒神经元前体细胞，是一种单潜能颗粒神经元祖细胞，只能分化为颗粒神经元。在小鼠模型中，研究人员使用特定作用于颗粒神经元前体（GNP）的Math1-Cre基因来标记肿瘤细胞使其突变，但其不作用于TME细胞。通过Math1-Cre报道基因对肿瘤GNPs特定标记进行体内分析，通过percol梯度离心技术将其高度纯化进行体外分析。杂合Ptch1突变导致SHH通路信号上调导致导致肿瘤发生的极大风险，而P53基因缺失导致患者生存率低下且缩短小鼠模型中全外显率肿瘤发生的潜伏期。

大脑是一个免疫豁免器官，小胶质细胞是基本组织原位巨噬细胞，脑特异性星形胶质细胞充当非专业免疫细胞，这提供一个相对简单的系统来解释不同细胞之间的相互作用。研究人员为髓母细胞瘤创建了一个基于MADM的小鼠模型，通过该模型发现了一个复杂的TME多边网络，该网络是通过转分化和多边旁分泌信号传导形成。

基于MADM及其他遗传模型的髓母细胞瘤系统建立

为了研究不同TME细胞对于SHH亚型髓母细胞瘤（以下均将SHH亚型髓母细胞瘤称髓母细胞瘤）作用，研究人员建立了基于MADM的遗传模型，在Ptch-1（+/-）杂合子，P53(+/-)杂合子小鼠中利用Math1-Cre基因技术产生Ptch-1（+/-）杂合子，P53（-/-）缺失和GFP+ 的GNPs。Math1-Cre基因能准确标记GNPs，而不是潜在的TME细胞类型。

除了基于MADM的模型之外，在这项研究中，使用了另三种稍加修改的小鼠模型来解决某些特定问题。在模型B中，Math1-Cre和Cre报道基因用于使GNP中特定基因失活，以至分化为其他细胞类型后仍能追踪肿瘤谱系。在模型C中，Math1-GFP被用作标记肿瘤细胞，以将其与TME细胞区分；在模型D中，未携带Cre基因的髓母细胞瘤模型使研究人员能够在特定的时间或在特定所需的TME细胞类型中植入Cre基因来进行功能分析。所有这些都是具有完整免疫系统的遗传模型，并且没有肿瘤移植模型中常见的损伤相关的并发症。

随着肿瘤进展的TME细胞的逐步积累以及来源于肿瘤细胞的星形细胞样细胞的转分化发现肿瘤组织免疫荧光分析表明MADMs模型的各个阶段都存在人髓母细胞瘤中观察到的所有类型的TME细胞（图1H-1J）。不同的TME细胞以不同的速度生长。随着肿瘤的进展CD31+内皮细胞也在增加（图1H'），IBA-1+ 肿瘤相关小胶质细胞或巨噬细胞(TAM)及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) +星形胶质细胞在肿瘤发病初期急剧升高,然后稳定持续存在(图1 I'和J'）。

小胶质细胞和星形胶质细胞是很少出现在正常外颗粒层(EGL)，外颗粒层正是肿瘤起源的部位（图1I'和J'，第一条）。正因为其突然和丰富的存在而且甚至在最小的肿瘤中也如此，对于提示肿瘤恶性程度非常关键。与正常脑区(图1H-1J和1N)相比，肿瘤区血管腔增大(图1H)， I BA-1+细胞衍生物减少(图1I)，肿瘤组织GFAP+表达升高(图1J)，提示TME细胞与肿瘤细胞共同进化。

在每个检查的肿瘤中，肿瘤组织中所有星形胶质细胞(GFAP+)都是GFP+(图1M)。确定Math1-Cre对GNPs进行了准确的标记，而不是正常星形胶质细胞，这表明髓母细胞瘤中GFAP+GFP+细胞很可能是TuGNPs来源的，而不是正常的星形胶质细胞(肿瘤GNPs以下简称TuGNPs)。

除GFAP以外，星形胶质细胞的另一标记物脑脂结合蛋白（BLBP），显示出与GFP重叠的染色（图S1F和S1F'）。BLBP + GFP +细胞被限制在肿瘤区域，但在相邻的正常区域中从未被发现（图S1F'与图S1F''）。

研究人员建立了一个髓母细胞瘤模型，其中GNP谱系用tdTomato标记(模型B)，星形胶质细胞用星形胶质细胞特异性的Aldh1L1-GFP细菌人工染色体(BAC)转基因标记。观察到GFP和tdTomato在这些细胞上共同表达(图S1G)进一步支持了这些TuGNP来源细胞的星形胶质细胞特性。

最后，还注意到这些GFAP+细胞与正常星形胶质细胞有显著的形态相似性。在正常小脑中进行Bergmann胶质细胞的表型复制（图1N）， GFP+ GFAP纤维的放射状排列在早期至中期肿瘤的边缘高度明显(图1O和图1P)。此外，GFP标记的星形胶质细胞样细胞与整个肿瘤区域的血管紧密相关（图1Q和1R）。综上所述，MADMs提供的细胞分辨率不仅揭示了TME细胞在肿瘤进展过程中的协同进化过程，还意外发现了TuGNPs向星形胶质细胞的潜在转分化。

图1（H和H’）肿瘤相关血管的内腔大于邻近的正常组织血管内腔（N）。与正常的EGL相比，随着肿瘤的进展，血管生长逐渐增加（n=3、4、4和3）。（I和I’）EGL中含有很少小胶质细胞，但却随着肿瘤进展明显增多（n=3）。（J和J’）EGL中不存在星形胶质细胞，但在肿瘤中明显存在（n = 3）。（K-M）血管（K）和小胶质细胞（L）均不表达GFP。与之形成鲜明对比的是，肿瘤（M）中的所有GFAP +细胞均为GFP+。(N)在正常小脑中，GFAP+Bergmann胶质细胞呈扩张放射状通过分子层（ML）（虚线勾画）。（O）在肿瘤的病灶区域可以发现相似的GFAP+放射状组织过程（虚线勾画）。（P）（0）中框形区域的放大。（Q和R））肿瘤来源的星形胶质细胞（GFP+GFAP+）与血管（CD3+）密切相互作用，通常包裹整个血管（R；Q中方框区域的放大更高倍率）。

图S1 (F) GFP +星形胶质细胞仅存在于肿瘤（F'）中，而不存在于无肿瘤的脑区域（F’’）中。(G)一种小鼠髓母细胞瘤模型，其中所有来自GNP的细胞谱系均为tdTomato +，而星形胶质细胞被Aldh1L1-GFP标记。如果肿瘤相关的星形胶质细胞来自肿瘤细胞，则它们应显示为黄色（Aldh1L1-GFP +和tdTomato+）。

来源于TuGNPs的星形胶质细胞转分化及其与人类是否存在相关性

研究人员排除了观察到的转分化的其他解释。首先虽然Math1-Cre可以准确标记正常大脑中的GNPs，但Mathl启动子在星形胶质细胞被募集到肿瘤后可能被错误激活，此次MADM的双色设计很容易排除了这种可能性，启动子泄漏会导致黄色星形胶质细胞，而这种现象在所有肿瘤中都从未见过。其次在分别检查了10个肿瘤的1000多个BLBP+GFP+细胞，从未观察到双核细胞，星形胶质细胞与GFP标记的TuGNPs之间的细胞融合的可能性被排除了。

以防细胞融合后细胞核融合形成单核融合细胞，研究人员建立了一个髓母细胞瘤模型，其中所有GNPs都用GFP标记（模型D），所有星形胶质细胞都用tdTomato标记，观察是否黄色星形胶质细胞生成。在对4只荷瘤小鼠中检查了100多个tdTomato +细胞后，未观察到黄色TME星形胶质细胞，这明确排除了细胞融合的可能性。在模型C中，即使所有肿瘤细胞均使用Mathl-GFP标记，但所有星形胶质细胞均为GFP阴性(数据未显示)，排除了GFP蛋白从TuGNPs转移到星形胶质细胞的可能性。

为了更明确地确定这些“星形胶质细胞样”细胞的身份，采用激光捕获显微切割(LCM)及RNA测序技术分析了它们的转录组。不进行免疫染色的情况下可视化肿瘤组织中的靶细胞，使用了一种小鼠模型，其中TuGNPs为红色，肿瘤来源的星形胶质样细胞为黄色，正常星形胶质细胞为绿色（模型B）。对组织处理程序进行了广泛优化之后，避免未固定组织中荧光蛋白的扩散损失，从每个肿瘤样本中收集了约250个星形细胞样细胞。在提取RNA，扩增cDNA，并确认LCM收集的星形胶质样细胞，TuGNPs和正常小脑星形胶质细胞的纯度后，进行了RNA测序，后进行无监督聚类转录组分析（每个n = 4）。研究人员发现星形胶质细胞样肿瘤细胞比起TuGNPs更倾向正常星形细胞聚集(图2C)。在星形胶质细胞样细胞中，几乎所有TuGNPs特异性转录物均下调（图2C，顶和2D，底），而许多星形细胞特异转录物上调（图2C，底部和2D，顶部），表明广泛的转分化。由于星形细胞样细胞与正常星形细胞在约2500个独特表达的转录物(图2C，中心)中极为相似，但仍有差异，称为“肿瘤微环境星形胶质细胞（TuAstrocytes）”。

最终，运用两种方法来调查长期存在于髓母细胞瘤中的星形胶质细胞成分是否来源于TuGNPs。第一种方法，使用了原代SHH亚型髓母细胞瘤，将其连续异种移植到患非肥胖型糖尿病（NOD）/严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠脑中，并通过沿代基因表达谱进行验证。能观察到所有被检测的异种移植肿瘤中有人类GFAP特异性免疫反应（图S2J）。因为这些肿瘤细胞已通过多次传代移植来消除非肿瘤细胞，所以这些人类GFAP +细胞最有可能从TuGNPs分化而来。

第二种方法，通过对PTCH1（9q22.33）和相邻位点（9q21.33）行双色荧光原位杂交（FISH）及GFAP免疫荧光染色，评估了肿瘤内每个星形胶质细胞的染色体完整性。为了确保这些患者不是这种核型异常的种系携带者，混淆数据，先行证实肿瘤组织中大多数内皮细胞具有正常的核型（图2F）。在6例病例中有6例（图2H），GFAP +细胞具有与肿瘤细胞同等水平的单等位基因PTCH1-9q21.33丢失（图2G），这表明这些星形胶质细胞与有着同样遗传损伤肿瘤细胞具有相同的谱系。在详细的验证了所有可能的替代解释之后，我们得出结论，TME中的星形胶质细胞（TuAstrocytes）来自于小鼠模型和人髓母细胞瘤患者中的TuGNPs。

图2（C）TuGNPs，正常星形胶质细胞和TuAstrocytes的RNA-seq数据的层次聚类分析。（D）许多星形细胞标记物在TuAstrocytes中升高，而特异性TuGNP基因却降低。

图2（F）内皮细胞（CD31+）具有正常的核型（两个红色的FISH信号，带有星号的细胞在右侧被放大），而周围的肿瘤细胞只有一个红色的信号（箭头），表明丢失了一个含PTCH1的染色体片段。（G）在GFAP+细胞中（右侧为放大了的带有星号的细胞）从9q21.33区域到PTCH1位点丢失了一个等位基因，与周围的肿瘤细胞一致（箭头）。（H）定量分析显示，六个患者样品中的大多数TuGNP和TuAstrocytes均具有相同的异型。

图S2（J）连续异种移植的SHH亚型人类髓母细胞瘤细胞（此处显示第12代）产生的分散细胞具有星形细胞形态，在整个肿瘤中对人GFAP蛋白染色呈阳性，这表明人类髓母细胞瘤肿瘤细胞的转分化活性可以长期维持。

星形胶质细胞似乎支持肿瘤进展

GFAP不仅是星形胶质细胞的标记基因，也是神经干细胞的标记基因。由于无法纯化活的TuAstrocytes（数据未显示），研究人员建立了一类小鼠髓母细胞瘤模型，其中在他莫昔芬注射后用RFP标记TuAstrocytes（模型D），如果TuAstrocyte能起肿瘤干细胞的作用，在较长时间后能找到RFP + TuGNPs 。然而，在他莫昔芬注射后2周没有观察到红色的TuGNPs（图3B）。以防需要更多的时间来使TuAstrocytes产生TuGNPs，研究人员将来自该模型的未标记原发肿瘤移植到NOD-SCIO小鼠中，在肿瘤开始生长后给予他莫昔芬治疗，2个月后仍未观察到任何RFP + TuGNPs（图3C），所以并不支持TuAstrocytes表现出肿瘤干细胞的作用。

研究人员在出生后35天（P35）的Ptch-1(+/-)小鼠中的小脑表面识别了癌前病变（PNL）之后，评估了星形胶质细胞总量与GNPs增殖状态之间的相关性（图S3A和S3B）。在30多个PNLs中，发现星形胶质细胞的存在与GNP增殖密切相关，反之亦然（p <105,Fisher检验；图S3C），表明星形胶质细胞可能在癌前病变（PNL）进展中起重要作用。

其次，当在体外培养纯化的TuGNPs时，研究人员观察到分散的细胞迅速停止增殖，但那些聚集的细胞却显示出强大的增殖能力（图S3D）。为了研究TuAstrocytes是否参与，研究人员从用于LCM实验的Aldh1L1-GFP模型中制备了RFP + TuGNPs（图S2E，模型B）。尽管最初所有的细胞都是红色的，但在培养的第3天，GFP + TuAstrocytes开始出现聚集（图S3E和S3G），并在第6天出现大幅度增加（图S3F和S3G）。这表明在培养中自发的TuGNPs到TuAstrocytes转分化和球形扩张形增加同时存在，两者合计得出结论，TuAstrocytes不是肿瘤干细胞，而是很可能对TuGNPs起支持作用。

图3(B) 他莫昔芬注射后2周后TuAstrocytes未产生TuGNPs。(C) 即使2个月后，TuAstrocytes也未产生TuGNPs。

图3S（A-C）在PNL中，TuGNPs的增殖与TuAstrocytes的存在密切相关。（E-G）TuAstrocytes（Aldh1L1-GFP+）逐渐出现在肿瘤球形细胞团

IGF1是支持肿瘤生长的TME因子

通过测试一组已知的对大脑发育和肿瘤进展很重要的八种生长因子来检验TuAstrocytes如何促进肿瘤进展。首先，运用qRT-PCR技术来比较它们在肿瘤和正常脑中的表达水平，并假设候选因子应该在肿瘤中始终以更高的水平表达，确定了三种候选因子：胰岛素样生长因子1（IGF1），肝细胞生长因子（HGF）和血小板源性生长因子A（PDGF-A）在肿瘤中始终表达2倍甚至更高水平。为了区分是TME来源还是肿瘤内在因素，分别在肿瘤组织和纯化的TuGNPs上对这三种因子做配对qRT-PCR。发现IGF1和HGF是来源于TME，而PDGF-A却不是且IGF1而非HGF以剂量依赖性方式促进细胞培养中TuGNPs的增殖。

建立了小鼠模型验证，其中IGF1受体（IGF1R）在GNPs中被特异性地进行基因删除（模型C加上IGF1R-flox等位基因，以下称为胰岛素生长因子1受体条件性基因敲除（IGF1R-CKO））。发现与同一阶段的对照组相比，IGF1R-CKO小鼠的肿瘤要小得多。IGF1R-CKO小鼠的存活时间比IGF1R-野生型(IGF1R-WT)和IGF1R-杂合小鼠长得多。在研究终点（P130）进行脑组织学检查，在IGF1R-CKO小鼠脑中只发现少量肿瘤细胞，这表明IGF1R信号传导在髓母细胞瘤中起着不可或缺的作用。

由于Math1-Cre在GNP的整个发育过程中表达，因此该模型中无法形成肿瘤可能是由于IGF1R失活时所致GNPs发育缺陷所致。为了排除这种可能性，建立了另一种小鼠模型，其中IGF1R缺失是由他莫昔芬依赖性Math1-CreER介导的（图4H，模型D）。确认他莫昔芬对肿瘤进展无影响后，肿瘤形成后（P40）注射他莫昔芬使TuGNPs上的IGF1R失活。与其对照组相比他莫昔芬处理过的小鼠中的肿瘤更小（图4I和4J），表明了在TuGNPs中IGF1信号的急性失活减缓了肿瘤进展。

为了探究肿瘤缩小的原因，研究人员进一步检查了TuGNPs的凋亡指数和细胞周期退出指数，发现与IGF1R-WT TuGNPs相比，IGF1R缺失的TuGNPs更容易死亡和退出细胞周期（图S4G-S4I）。这些数据表明，TME来源的IGF1信号传导不仅对髓母细胞瘤的发生而且对于持续进展都至关重要。

图4（H-J）在肿瘤发生后建立IGF1R失活髓母细胞瘤模型；他莫昔芬（150 mg / kg）诱导的肿瘤GNPs中IGF1R的失活抑制了肿瘤的进展（每组n = 8）。

图4S（G-I）与对照组相比，他莫昔芬治疗组的凋亡细胞更高。 与对照组相比，他莫昔芬治疗组中有更多的细胞退出细胞周期（BrdU + Ki67-）。

IGF1是由TAMs分泌的，而不是由TuAstrocytes分泌的

因为TuAstrocytes是由TuGNPs转分化而来，研究人员建立了一个互补的小鼠模型，用Math1-Cre（模型C加IGF1-flox等位基因）使IGF1失活，IGF1基因敲除（KO）模型未能减慢肿瘤的进展，怀疑TuAstrocytes可能不是IGF1的细胞来源。

RNA原位杂交检测IGF1及免疫荧光染色检测细胞类型，发现IGF1是由IBA-1 +肿瘤相关髓系细胞（TAMs）特异性产生，而不是TuAstrocytes（图5A和5B）。虽然约70％的TAMs是IGF1 +，但在正常脑区（正常vs肿瘤区，图5A，中部；在图5C中量化）的小胶质细胞中未检测到IGF1。

亲和纯化TAMs和小胶质细胞后，进一步通过qRT-PCR确定了TAMs中IGF1的表达水平比正常小胶质细胞高出一个数量级（图5D）。共培养纯化TAMs和TuGNPs表明，TAMs以密度依赖性方式促进TuGNPs增殖，且主要依赖于IGF1。

建立另一个髓母细胞瘤模型，其中IGF1被髓系特异性CSF1R- Cre将其失活（图5H，模型D）。发现在出生后35天小鼠（P35）中特异性删除IGF1的TAMs与IGF1-WT相比肿瘤更小（图5I和SJ，n> 1O），表明TAMs来源的IGF1在肿瘤的发生起支持作用。

图5 (A和B)原位杂交显示IGF1是由IBA1 +TAMs产生，而不是由正常的小胶质细胞产生的。低倍率（A）和高倍率（B）。(C)产生IGF1的IBA1 + TAMs的比例（n = 4）。(D)qRT-PCR比较经快速纯化的小胶质细胞和TAMs中IGF1表达水平。（H）敲除TAMs上IGF1的髓母细胞瘤小鼠模型。

TAM是局部激活的小胶质细胞，而不是循环单核细胞来源的巨噬细胞

为什么大多数TAMs表达IGF1但却很少的正常小胶质细胞表达IGF1？一种可能的解释可能是它们的不同起源。小胶质细胞源于胚胎卵黄囊，并受大脑环境影响而形成，与循环单核细胞来源的巨噬细胞本质上是不同的因此，TAMs中IGF1表达的升高可能意味着TAMs来自循环单核细胞来源的巨噬细胞，尤其是因为我们注意到TAMs的形态与原位小胶质细胞极度不同。

研究人员使用谱系追踪方法，以区分小胶质细胞与单核细胞来源的巨噬细胞，最初标记的单核细胞将因干细胞的快速更新而被干细胞来源的未标记的单核细胞所替代，而小胶质细胞则由于其缓慢而局部的补充而仍会被标记。为了避免在肿瘤早期被标记的单核细胞无法更新这种微小可能性，在小鼠生后7天（P7）即肿瘤发生很久前注射他莫昔芬。在P40肿瘤还很小时检查脑组织，在P60时肿瘤完全进展时再次检查，我们发现肿瘤所有TAMs都被tdTomato标记，表明它们起源于小胶质细胞（图6B-6 E）。

继续对纯化的TAMs进行RNA测序（RNA-seq）分析及层次聚类分析表明，与循环单核细胞来源的巨噬细胞相比，TAMs与小胶质细胞的转录组相似性更高（图6F和6G）。TAMs与正常的小胶质细胞相比，基因表达发生了显著变化，并且与正常的小胶质细胞之间的差异比脂多糖（LPS）处理的小胶质细胞相比更大（图6G），表明局部TME因子对其影响很大。

除了小胶质细胞外，最近的一篇论文还报道了脑膜巨噬细胞的更新也很慢，这也可能是标记TAMs的一个来源。葡聚糖染色标记脑膜巨噬细胞，在第3天及第7天时检测均未发现浸润，表明脑膜巨噬细胞不太可能是TAMs的主要来源。综上所述，这些数据表明TAMs起源于小胶质细胞，并经历可能由TME因子诱导的显著形态和功能变化。

图6（B和B’）TdToma+TAMs存在于小型肿瘤中（虚线标出，n = 3）。（C-E）在成熟肿瘤中tdTomato+TAMs大量存在于Math1-GFP +肿瘤组织。低倍率（C），高倍率（D）和量化（E）。（F）本研究与Bennettet等人（2016）发表的数据组之间的P60小胶质细胞的转录组学数据皮尔森相关系数表明这两组数据高度相关。

IL-4信号负责通过刺激TAMs提高IGF1表达

因为TAMs起源于通常不表达高水平IGF1的小胶质细胞，研究人员提出了以下假设：TAMs中IGF1表达是由TME因子诱导的免疫状态改变引起的。首先对TAMs的RNA-seq数据进行了全面的生物信息学分析，将其与正常小胶质细胞对比，重点放在致耐受特征基因上，此前已证明其可促进肿瘤发生，在4,898个上调的基因和4,521个下调的基因中，发现了总体致耐受特征，包括倾向于产生IL-10，对适应性免疫的负调控，对炎症反应的负调控，及与Th2免疫相关的因子以及IL-4介导的信号传导。

研究巨噬细胞/小胶质细胞中已知诱导IGF1的两条通路：IL-4和肿瘤坏死因子α。Luminex（多功能液相芯片分析技术）分析所得数据：IL-4通路中的基因在TAMs中普遍升高，尤其是那些依赖STAT6引发的基因（图7A）。观察到在巨噬细胞中由IL-4相关激酶调控的差异表达基因显著增加，包括JAK2和ERK1-ERK2。相反，已知由TNF-a刺激巨噬细胞诱发的基因通常被下调，包括依赖于TNF-a通过核转录因子KB（NF-KB）和AP1信号传导的基因（图7B，蓝色条），而被TNF-a抑制的基因却被上调（图7B，红色条）。表明肿瘤中IL-4升高，但TNF-a却没有。

为了研究其功能相关性，纯化肿瘤中TAMs，发现在IL-4刺激后IGF1表达的明显增高（图7D）。在一项补充实验中，建立了具有无IL-4背景下小鼠髓母细胞瘤模型（图S7C，模型C）。尽管IL-4 KO不会改变肿瘤中TAMs的数量（图S7D），但却明显导致肿瘤中IGF1表达降低（图7F）。因此，这组实验表明，IL-4对于促进TAMs中IGF1表达是充分必要的。

图7 （A-B）对TAMs中差异表达基因的通路分析显示，与IL-4相关的信号显著上调（A），但TNF-a信号却没有（B）。（D）IL-4刺激快速纯化TAMs导致培养中IGF1水平升高。（F）IL-4 KO导致肿瘤中IGF1表达水平降低。

图S7（C）原位杂交显示在IL4 KO荷瘤小鼠中不能检测到IL4 mRNA，证实了基因敲除的有效性。（D）对IBA 1进行免疫荧光染色显示，IL4野生型和IL4 KO肿瘤中TAMs细胞密度相似。

IL-4由TuAstrocytes产生

已知IL-4的主要来源于Th2淋巴细胞，所以在使用PBS缓冲液进行心内灌注仔细去除血液中的免疫细胞后对TME中的免疫细胞类型进行全面分类。数据表明，髓母细胞瘤中98％以上CD45 +免疫细胞是髓系标记CD11b阳性（图7G）。考虑活化T和B淋巴细胞和成熟的自然杀伤（NK）细胞中CD11b表达的可能性，对T细胞（CD3），B细胞（CD19）和NK细胞（NK1.1）进行了进一步的流式细胞术分析。该分析未发现对肿瘤中的T淋巴细胞标记CD3的免疫染色（图S7E和S7F），表明肿瘤中仅存在少量的T，B和NK细胞。综上所述，由于缺乏T细胞浸润，研究人员推测IL-4不是来源于Th2淋巴细胞而是一定是TME细胞。

进一步对IL-4进行了原位分析检测，并对细胞类型特异性标记物进行了免疫染色。确定了GFAP +星形胶质细胞是IL-4的主要来源（图7I和7 I'）。为了研究IL-4是由正常星形胶质细胞还是由肿瘤来源的星形胶质细胞产生，研究人员建立了一个小鼠模型，该模型包含了肿瘤谱系标记（tdTomato）和IL-4-GFP报道基因（模型B）。发现所有IL-4-GFP +细胞上均表达GFAP和tdTomato，这表明IL-4是由TuAstrocytes而不是正常星形胶质细胞特异产生的（图7J和7K）。

图7 （I和I’）原位杂交技术显示IL-4是由肿瘤组织中GFAP +细胞产生的。(J)所有的lL4-GFP+细胞均为tdTomato+和GFAP +，表明IL-4的分泌是由TuAstrocytes产生的。(K)量化分析表明，IL-4在50％的TuAstrocytes中表达，但在正常的星形胶质细胞或TuGNPs中不表达。

图S7（E和F）CD3免疫荧光染色显示在肿瘤中没有检测到T细胞。

讨论

通过全面的谱系追踪，分子分析和功能研究，我们证明了髓母细胞瘤中的TME成分形成促进肿瘤进展的复杂网络（图7L）。要开发针对TME的新型肿瘤治疗策略，必须深入研究TME的建立和功能，尤其要注意时间，空间，细胞谱系以及同型和异型细胞之间的相互作用。

MADMs系统提供空间分辨率以降低TME的复杂性

MADMs系统利用其谱系追踪能力来发现肿瘤与TME之间的关系。这种相互作用的复杂性可以从表面上看似“简单”的肿瘤上揭示出来，进一步强调在更复杂的肿瘤中解开TME内在功能的重要性。

TuGNPs向TuAstrocytes转分化：肿瘤中的通路建立行为

对人髓母细胞瘤样本进行核型分析证明了在肿瘤组织中肿瘤GNP与星形胶质细胞样细胞成分之间的谱系关系。此次研究新颖性在于两个方面。首先，从GNP向星形胶质细胞的转分化必须克服发育程序中的重大障碍，因为GNP池和产生星形胶质细胞的神经干细胞池在时间（从小鼠胚胎发育的第9.5天[E9.5]开始）及空间上（GNP驻留在小脑原基表面的EGL中，而神经干细胞（NSCs）驻留在脑室区，即在第四脑室的神经管的最内层）是分离的。其次，尽管在这项研究中揭示了转分化TuAstrocytes功能作用，但是还有待观察其他肿瘤类型中的转分化的细胞是否也起着如此重要的作用。

尽管如此，仍有许多未解决的问题。首先，转分化的机制什么？第二，在整个肿瘤进展过程中如何维持约1％的TuAstrocytes成分？最后，尽管我们观察到TuAstrocytes直接支持肿瘤进展的提示，但我们的研究却意外地转向了TuAstrocytes，TAM与肿瘤细胞之间网络的发现。将来，重要的是研究TuAstrocytes对肿瘤细胞的直接支持因子，并探讨它们在维持血脑屏障（BBB）方面的作用，因为SHH亚型髓母细胞瘤与Wnt亚型形成鲜明对比的是前者几乎没有血脑屏障（BBB）破坏。

虽然研究发现了在髓母细胞瘤中由TuAstrocytes和小胶质细胞形成的抗炎免疫网络，然而在其他情况下，小胶质细胞和星形胶质细胞相互激活以建立促炎环境。

除了激活大脑的先天免疫系统之外，将适应性免疫细胞引入脑实质中可以促进脑肿瘤的治疗。此次建立的髓母细胞瘤模型中很少发现T，B或NK细胞，这与先前人髓母细胞瘤样本中的发现一致。并且当T细胞到达肿瘤时，T细胞的关键细胞因子，例如IL-2和IL-15在我们的髓母细胞瘤模型中也都过低，以至无法支持其生存。这一发现与最近的临床研究所表明的相吻合，细胞毒性T细胞的存在与髓母细胞瘤患者的总体生存率无关，并且神经胶质瘤中T细胞的耗竭极为严重。

大脑对化学物质和电信号失衡极为敏感，并且可能因为细胞因子风暴或其他明显的免疫反应而受到严重损害。因此，只有牢固掌握了神经免疫学知识之后，才能证明基于T细胞的免疫疗法在脑肿瘤中的有效性。

通过多边旁分泌回路了解肿瘤的内在稳定性，制定有效的治疗策略

尽管详细的分子机制值得进一步探讨，但清楚地揭示了髓母细胞瘤中TME网络的复杂性未得到充分认识。研究数据表明不是一对一的TME-肿瘤串扰影响，而是揭示了一个错综复杂的TME网络，转分化和多边旁分泌支持肿瘤细胞的生长。

虽然这项研究的重点是髓母细胞瘤的SHH亚型，但它展示了一个强大的生物技术平台，可用于研究其他肿瘤类型的TME网络。加深对TME与肿瘤细胞之间关系的理解，为切断多边旁分泌的串扰，从基础上转变破环肿瘤生长的传统的治疗策略带来了巨大希望。

编译作者

邝苏慧，现就读于国家儿童医学中心-首都医科大学附属北京儿童医院，硕士-专业方向为神经外科。

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