李思妮, 王鑫, 白桦, 王洁. 肿瘤突变负荷对非小细胞肺癌免疫治疗效果的预测价值[J]. 中国医学前沿杂志（电子版）, 2019, 11(12): 18-23.

作者单位：

李思妮，王鑫，白桦，王洁（国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院 肿瘤内科，北京 100021）

【摘要】 肺癌的高发病率和高致死率均位居全球癌种前列，这已成为当今世界健康领域迫切需要解决的问题。不同于针对肿瘤细胞的传统化疗、放疗和靶向治疗，近年来针对全身免疫系统的免疫检查点抑制剂治疗逐渐走进人们的视野，这种新型的治疗模式在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的治疗中取得了突破性进展。然而免疫治疗的获益人群有限，因此需要借助有效的生物标志物来筛选出获益人群。大量临床研究表明肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）是一种潜在的独立生物标志物，可预测NSCLC免疫治疗效果，本文将对TMB和基于TMB的NSCLC免疫治疗效果的预测价值和最新临床研究进展进行综述。

【关键词】 非小细胞肺癌；免疫治疗；免疫检查点抑制剂；肿瘤突变负荷

恶性肿瘤已成为我国居民健康的重要杀手，其中肺癌是造成人类死亡的最常见癌种，且高居榜首。肺癌分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中NSCLC占肺癌的85%以上[1]。大量研究表明，驱动基因阳性晚期NSCLC患者能从小分子受体酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治疗中明显获益，且随着肺癌一系列致癌驱动基因的确定，肺癌的分型逐渐细化为基于驱动基因的分子亚型，故驱动基因阳性晚期NSCLC的治疗也更为精准[2]，但患者最终会对靶向药物产生耐药，因此需要替代治疗方案来改善晚期NSCLC患者的预后[3]。长期以来，基于铂类的标准化疗一直是驱动基因阴性晚期NSCLC患者的主流一线治疗，但效果有限。近年来随着免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）如抗程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）和抗程序性死亡蛋白配体-1（programmed death-ligand-1，PD-L1）抗体的发展，极大地改变了驱动基因阴性晚期NSCLC的治疗前景[4]。

尽管免疫治疗取得了突破性进展，但仍有约80%未选择的NSCLC患者对PD-1或PD-L1抑制剂无应答。因此，为了更好地筛选获益人群，确定能够预测ICIs疗效的最佳生物标志物至关重要[5-7]。通过免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检测到在肿瘤细胞上表达的PD-L1已作为一种生物标志物用于筛选NSCLC免疫治疗获益人群，并被FDA批准作为伴随诊断测试（companion diagnostic test，CDx），然而使用PD-L1作为生物标志物仍然有一定局限性[8]，故迫切需要探寻更可靠的生物标志物[7-9]。近年来，肿瘤突变负荷（tumor mut­a­tion burden，TMB）成为研究热点，它是一种具有广阔前景的、独立的预测生物标志物，有望为肿瘤免疫治疗进入精准医疗时代开辟道路[10]。本文讨论了TMB及其对晚期NSCLC患者ICIs治疗效果的预测价值以及当前进展和挑战，旨在为未来的研究提供一些思路。

1 非小细胞肺癌患者的免疫检查点抑制剂治疗

ICIs通过与抑制性的共受体结合阻断抑制信号，从而增强T细胞活化和增殖，发挥抗肿瘤作用，目前研究最多的当属抗PD-1、抗PD-L1和抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）抗体[11]。1期CA209-003研究显示，Nivolumab用于治疗既往接受过多线治疗的晚期NSCLC，患者5年生存率高达15.6%[12]。3期KEYNOTE-024研究也显示与化疗相比，Pembro­li­z­­umab一线治疗PD-L1高表达的晚期NSCLC能显著延长患者的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progress free survive，PFS），且不良反应较轻[13]。随后的KEYNOTE-189研究进一步显示，与单纯化疗相比，在初治、无表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）或ALK突变的转移性非鳞状NSCLC患者中，Pembroli­zu­mab联合培美曲塞和铂类的标准化疗显示出更长的PFS和OS[14]。另51%～87%的NSCLC患者表达CTLA-4，针对这一途径的ICIs正在研究中[15]。最近一项大规模的荟萃分析也显示，与常规治疗相比，ICIs治疗能显著延长NSCLC患者的OS与PFS[16]。

越来越多的研究显示ICIs治疗已经在生存率、疾病管理、耐受性和替代化疗方面取得了巨大的进步，目前Nivolumab、Pembrolizumab和Atezoliz­umab已被FDA批准用于经治的NSCLC患者，Pembro­lizu­mab也获批用于PD-L1表达＞50%的NSCLC患者的一线治疗。此外，Durvalumab也被批准作为同步放化疗后的巩固治疗用于PD-L1阳性的Ⅲ期NSCLC患者[15,17]。当前各种组合治疗的临床试验正在如火如荼地进行，以帮助确定晚期NSCLC的最佳治疗方案，实现个体化精准治疗。

2 何为肿瘤突变负荷?

在了解TMB之前，我们首先应了解生物标志物的概念。生物标志物的特征在于能客观测量和评估，是一种能够体现正常生理过程、病理过程或治疗干预后药理学反应的指标，可用于预测患者对特定治疗的疗效并评估预后[18]。目前候选的预测生物标志物包括肿瘤抗原[TMB、微卫星不稳定性（microsatellite inst­ab­i­lity，MSI）、新抗原等]、炎性细胞[肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）、基因标志物、表达PD-L1蛋白的肿瘤相关免疫细胞等]、肿瘤免疫抑制细胞或蛋白（PD-L1、CTLA-4、调节性T细胞、骨髓来源的抑制性细胞、吲哚胺-2,3-双加氧酶、淋巴细胞活化基因3等）和宿主因子（微生物、单核苷酸多态性等）[19]。

TMB是近年来受到广泛关注的一种明星生物标志物，被定义为基因编码区域内每兆碱基体细胞非同义突变的总数，包括小插入缺失变异体[19]。由于长期接触烟草烟雾，NSCLC患者表现出更高的突变率[20]，在大样本人群中的全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）结果也表明，对抗PD-1/PD-L1抗体产生反应的肿瘤组织（包括NSCLC），具有很高的体细胞突变数量[21]。TMB值在不同肿瘤类型中有很大的变异性，在NSCLC中尤为广泛[20]，且其在同一肿瘤内也存在差异，如在携带EGFR、ALK、ROS基因突变的肺癌中，体细胞突变常显著减少，而KRAS或BRAF基因改变似乎并不影响肺癌组织中细胞突变[3]。

由于肿瘤细胞的非同义突变可导致新抗原的产生，肿瘤特异性新抗原的存在又与肿瘤免疫原性增加有关，机体的免疫系统识别大量的新抗原后能增强T细胞对肿瘤的活性，从而增强ICIs的疗效[7]。故TMB也是一种间接测量肿瘤新抗原的方法。Albor­elli等[22]也提到，若肿瘤呈现更高的TMB、更多的新抗原，则该肿瘤可能对免疫治疗有更好的反应。Rizvi等[20]的研究验证了上述假设，该研究通过对接受Pembr­o­lizu­mab治疗的两组NSCLC患者的外显子及其匹配的正常DNA进行测序，发现肿瘤中较高的TMB与患者的客观有效率（objective response rate，ORR）改善、PFS延长密切相关。另有研究表明高TMB与吸烟史[23]、MSI、DNA聚合酶、APOBEC等基因突变有关[9,24]。

3 肿瘤突变负荷可预测非小细胞肺癌患者免疫检查点抑制剂治疗效果

2014年Snyder等[25]通过使用全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）来鉴定与CTLA-4阻断相关的遗传基础，发现高TMB与免疫治疗效果有关，但研究者也指出仅依靠TMB不足以预测疗

效。随后在CheckMate-026临床研究中，研究者将Nivolumab和基于铂类的化疗分别用于晚期NSCLC的一线治疗，同时用WES测量TMB，并将患者分为三组（＜100 mut/Mb、100～242 mut/Mb、≥243 mut/Mb），结果显示，与化疗组相比，高TMB亚组（≥243 mut/Mb）患者使用Nivolumab治疗后有更长的PFS和更高的ORR[17]。

Ⅱ期CheckMate-568研究和Ⅲ期CheckMate-227研究结果也显示Nivolumab联合低剂量Ipilimumab作为晚期或转移性NSCLC的一线治疗是有效且可耐受的，无论PD-L1表达水平如何，使用Nivolumab联合低剂量Ipilimumab一线治疗的TMB≥10 mut/Mb的晚期NSCLC患者的PFS显著长于化疗组患者，ORR也更高，因此，TMB≥10 mut/Mb被认为是筛选免疫治疗获益人群的一个有效的cut-off值[26,27]。这两项研究均证实了Nivolumab联合Ipilimumab在晚期NSCLC患者中的治疗优势，以及TMB作为生物标志物预测晚期NSCLC患者免疫治疗效果的价值。基于这些临床研究，2018年10月，美国综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network）指南发布了非小细胞肺癌指南2019年第1版，TMB正式被列入其中，该指南也指出尽管TMB有助于筛选获益人群、预测免疫治疗效果，但其作为一种生物标志物尚处于研究阶段，对于如何测量TMB水平，目前仍未达成共识，仍是亟待解决的问题，需要后续进一步研究。

4 肿瘤突变负荷预测非小细胞肺癌免疫检查点抑制剂治疗效果的研究进展

由于高达30%的NSCLC患者没有足够的组织用于检测生物标志物，因此迫切需要探究新方法以确定哪些患者更有可能受益于免疫治疗。Gandara及其同事通过对POPLAR、OAK两项研究进行回顾性分析，评估了一种新的、基于外周血中循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的TMB（bTMB）检测方法，其中POPLAR研究为训练集，OAK研究为验证集。研究者首先使用两项研究中患者的组织和血浆样本进行了tTMB和bTMB的一致性分析，结果显示同一患者的tTMB与bTMB呈正相关（Spearman秩相关系数为0.64），证实了bTMB的分析效能。在POPLAR训练集中发现，当bTMB≥16时，Atezo­lizu­mab组患者的PFS和OS显著长于多西他赛组，故研究者选用bTMB≥16作为cut-off值，随后在OAK研究中进行验证，也得出相似结果。该研究指出，使用bTMB≥16的cut-off值可重复识别从Atezoli­z­umab获益最大的患者[17,28]。这项研究第一次证实了可在血浆ctDNA中准确、重复测量TMB，且高bTMB与ICIs治疗效果相关[28,29]。

2019年美国癌症研究协会（American Assoc­ia­tion for Cancer Research，AACR）年会报道了另一项Atezolizumab研究进展，B-F1RST研究是第一项评估bTMB作为预测Atezolizumab一线治疗NSCLC效果的前瞻性研究，该研究将bTMB≥16作为cut-off值，对患者进行分组（bTMB≥16、bTMB＜16），在生物标志物可评估患者[最大体细胞等位基因频率（maximum somatic allele frequency，MSAF）用于评估样品中ctDNA水平）≥1%]中，研究者发现高bTMB组较低bTMB组患者对Atezoli­z­u­mab有更高的ORR（28.6%∶4.4%），但在生物标志物不可评估患者（MSAF＜1%）中，也发现有较高的ORR（34.5%），这些患者由于ctDNA水平较低（MSAF＜1%）而无法评估bTMB。基于此结果，研究者进一步对比了MSAF≥1%和MSAF＜1% 2个亚组的临床结局，结果显示，与MSAF≥1%的患者相比，MSAF＜1%的患者基线具有更好的预后因素，而校正基线差异后，2个亚组ORR和中位PFS比较差异均无统计学意义，但这些结果并不会影响高bTMB对MSAF≥1%患者ORR的预测价值。目前bTMB试验的临床验证在B-F1RST和BFAST研究中继续进行，值得后续追踪。

大部分TMB的评估均通过二代测序（next-generation sequencing，NGS）来完成，NGS方法包括WGS、WES和NGS-Panel。由于WGS和WES分别对整个基因组、全外显子组进行测序，这两种方法昂贵且耗时，而NGS-Panel则集中于癌症相关基因，并与算法相结合，能快速报告癌症相关基因的改变[30]，其检测TMB的准确性与WES有很好的相关性[9,31]，但Panel的大小必须满足特定的要求，以保证检测TMB的精确性[32]。目前FDA已批准Foundati­onOne CDx和MSK-IMPAKT Panel用于临床试验[8,33]。通过NGS-Panel测定的TMB与WES测定的TMB之间的相关性，可以了解需要覆盖的最佳基因数量，从而正确推断TMB[3]。Wang等[34]利用癌症和肿瘤基因图谱的WES数据开发并验证了用于TMB评估的一种新型的癌症基因Panel（CGP），又称NCC-GP150。该Panel包括150个选定的癌症相关基因的整个外显子区域。将NCC-GP150检测的TMB与FDA批准的CGPs的TMB进行对比，发现TMB估测性能相当。在Rizvi等的NSCLC队列研究中完成虚拟验证后，研究者纳入48例具有肿瘤组织和血浆样本的NSCLC患者进行技术验证，结果显示，NCC-GP150 Panel估测的bTMB与WES估测的tTMB之间具有较好的相关性（Spearman秩相关系数为0.62），当NCC-GP150估测的bTMB≥6时，约登指数为最佳，敏感度和特异度分别为0.88和0.71。随后研究者又进行了临床验证，证实了NCC-GP150 Panel的临床可行性，在50例使用抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗的晚期NSCLC患者中，bTMB≥6的患者ORR高于bTMB＜6的患者（39.3%∶9.1%），PFS也显著延长。该研究也显示bTMB和PD-L1水平无相关性，这与既往tTMB的研究一致[34,35]。该研究系统地探讨了用于bTMB估计的靶向基因Panel的最佳大小和算法，证实了经NCC-GP150检测的基于ctDNA的bTMB可作为抗PD-1和抗PD-L1治疗NSCLC的潜在预测生物标志物。

另一项研究也证实了WES检测的TMB与NGS-Panel检测的TMB可用于预测NSCLC ICIs疗效，且这两种检测方法具有很好的相关性（Spearman秩相关系数为0.81）。值得注意的是，该研究中使用的大Panel基于中国人群。通过WES和大Panel对78例接受抗PD-1或PD-L1治疗的NSCLC患者进行全面的基因组分析，研究结果首次证实了TMB在中国肺癌患者中的预测价值同样有效，也证实了这一来自中国公司的Panel也能准确地检测TMB。此外，研究者还发现了携带FAT1基因突变且TMB高的患者从免疫治疗中获益更大，这也表明将TMB和其他潜在生物标志物结合，可能会提高对NSCLC患者ICIs治疗效果的预测能力[36]。

由于免疫治疗联合其他常规治疗极大地改善了晚期NSCLC患者的生存，为了进一步筛选获益人群，研究者迫切希望找到预测联合治疗效果的生物标志物，且研究表明TMB对PD-1联合CTLA-4阻断治疗NSCLC的疗效具有较强的预测作用[37]，那么TMB是否会影响ICIs联合化疗的NSCLC患者的疗效呢？第20届世界肺癌大会（World Conference on Lung Cancer，WCLC）给出了答案，会议报道了两项关于TMB研究的最新进展，其中，KEYNOTE-021研究通过肿瘤的WES和匹配的正常DNA确定tTMB，结果显示tTMB作为连续变量与Pembroli­z­umab联合化疗或单纯化疗一线治疗非鳞状NSCLC的ORR、PFS和OS均无明显相关性，tTMB与PD-L1表达也无明显相关性，在接受Pembrolizumab联合化疗治疗的患者中，tTMB与组织多态特异性抗原之间无显著相关性，且无论tTMB如何，均有较高的ORR；KEYNOTE-189研究结果同样显示tTMB与Pembro­l­izumab联合化疗一线治疗非鳞状NSCLC的疗效无相关性。上述两项研究均证实了TMB对Pembrol­izumab联合化疗的疗效无预测价值，故TMB仍是值得探索的难题，任重而道远！

5 肿瘤突变负荷在临床应用中的局限性和展望

尽管TMB已作为独立预测指标用于预测NSCLC患者ICIs治疗效果，但其仍存在许多局限性，如各研究结果的cut-off值不明确，虽有研究证明TMB对ICIs联合ICIs治疗NSCLC具有预测作用[33]，但现有研究也证实TMB对ICIs联合化疗治疗NSCLC无预测价值，且TMB检测没有标准化[4]。另一方面，组织标本的质量和数量、肿瘤组织异质性、不同的检测平台、相对较长的检测时间、昂贵的价格等均限制了tTMB的应用[10]。ctDNA在患者血浆中的检测率仍不高，且目前用于确定bTMB的Panel，均使用不同的基因、序列和cut-off值，导致研究结果缺乏协调性[38]。此外，TMB不能代表免疫原性的直接证据，也不能准确预测动态免疫反应。

当TMB与PD-L1相结合，可产生对ICIs疗效相加或协同的预测作用[4]，且在肿瘤细胞上无PD-L1表达或TMB低的患者中也可观察到ICIs的疗效[33]，故为了更准确地筛选获益人群，需要在未来创建一个预测生物标志物的系统，将TMB和其他与ICIs疗效有关的参数（如PD-L1、TILs、MSI、微生物等）相结合，以便进行精准预测[9,24,33]。也需要努力提高ctDNA的检出率，实现检测技术的均一化，并开展临床试验，前瞻性地评估bTMB对肺癌患者ICIs治疗效果的预测价值[38]。由于tTMB是一个连续的变量，故明确用于免疫治疗效果预测的cut-off值尤为重要[39]。

免疫治疗是肿瘤治疗的重要转折点，为肿瘤患者带来了福音。然而，并非所有患者均能从中获益，故急需探索高效预测免疫治疗效果的生物标志物。TMB已被证明是一种潜在有效且独立的可预测NSCLC患者ICIs治疗效果的生物标志物，已逐渐从临床研究走向临床应用，但其仍存在许多局限性，仅根据TMB对患者进行分类尚不能准确预测生存情况，故整合肿瘤基因和免疫微环境相关因子的生物标志物体系是未来研究的重点，需要建立多个生物标志物的综合评估模型，以指导个体化精准治疗。

参考文献（略）

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