06.22 柴毅 紀晨星 祝新根 高子云：外泌體在缺血性腦卒中的研究進展

本文標題：外泌體在缺血性腦卒中的研究進展 ；本文作者：南昌大學第二附屬醫院神經外科

柴毅、紀晨星、祝新根、高子云；本文發表在[J].中國病理生理雜誌,2018,34(03):572-576.本文轉載自醫脈通網站，神外前沿轉載已獲授權

外泌體在缺血性腦卒中的研究進展

1.外泌體概述

外泌體是直徑在30～100nm的胞外囊泡，通過細胞被釋放到細胞外液中。它們存在於生物體液中，諸如血液和腦脊液。外泌體攜帶有DNA、RNA、蛋白質和脂質等。由於外泌體的微泡結構為其內在的小分子提供了一個安全穩定的環境，同時這些信號小分子利用循環系統在胞間信號交換髮揮重要作用，這讓外泌體表現出一個成熟、穩定的信號傳輸系統。

研究發現，外泌體中的mRNA和microRNA（miRNA）可從一個細胞轉移到另一個細胞中，並在新的細胞中發揮功能。因此，外泌體是理想的細胞間信息傳遞媒介。

外泌體通過如下3種方式進行細胞間信息傳遞：膜融合後內容物釋放、膜表面信號分子以及信號分子胞外釋放。細胞可通過分泌外泌體對各種刺激作出應答，在腫瘤組織中，腫瘤局部缺氧可以促進乳腺癌細胞釋放更多的外泌體進入腫瘤微環境，進而促進腫瘤細胞的生存和侵襲。外泌體含有豐富的生物信息物質，具有在細胞間傳遞生物信息的獨特功能，新近研究發現外泌體在機體各種重要生理及病理生理過程中發揮著越來越重要的作用。

2.外泌體對缺血組織的保護作用

研究發現，血管內皮細胞在受到低氧刺激時能反應性地增加外泌體分泌，這些受低氧刺激分泌的外泌體，可被鄰近細胞攝取，或通過循環傳輸被遠處細胞攝取。

研究發現人體多種臟器，如心臟和腦等器官都能通過遠程缺血預處理提高缺血耐受能力。Vicencio等發現，在缺血處理後，血漿內外泌體大量增加，這些內源性外泌體通過外泌體表面膜蛋白，如熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70能夠呈遞信號給心臟組織，激活心肌細胞膜表面的Toll樣受體4，活化細胞外信號調節激酶和p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路，誘導HSP27磷酸化，從而提高心肌對於缺血再灌注損傷的耐受，達到心肌保護作用。

循環內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分泌的外泌體，通過轉運磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路相關mRNA，激活血管內皮細胞受體，並促進內皮細胞的增殖和成管，同時，EPCs來源外泌體內攜帶有促血管生成miRNA-126和miRNA-296，能上調血管生成因子，促進血管內皮細胞的增殖和分化，從而發揮其抗凋亡作用。

通過進行基因芯片分析中風組與非中風組動物的腦血管內皮細胞與神經祖細胞所分泌的外泌體中成分，發現2組外泌體內的蛋白質和miRNA均有大幅不同，這提示

中風能夠改變腦血管內皮細胞與神經祖細胞外泌體內成分。

此外，缺血組神經祖細胞分泌的外泌體能夠促進內皮細胞的遷移和成管，反之，缺血組內皮細胞外泌體能夠提高神經祖細胞的增殖與分化能力。這說明了卒中後腦血管內皮細胞與神經祖細胞能通過分泌外泌體，相互協調和促進神經發生與血管形成，從而發揮對缺血組織的保護作用。

3.外泌體與神經保護

短暫或更為持久的局灶性腦缺血引起的腦卒中涉及一系列病理生理反應，其中大腦損傷會產生並累積相關毒性蛋白，它們的降解與Nedd4家族相互作用蛋白1（Nedd4 family interacting protein1，Ndfip1）和泛素連接酶Nedd4的相互作用相聯繫。Putz等發現神經元來源的外泌體內含有Ndfip1和Nedd4，Ndfip1與泛素連接酶Nedd4能發揮損傷後移除毒性蛋白的功能。Bianco等已經證實在損傷的神經組織中，胞外ATP水平升高，使小膠質細胞和星形膠質細胞釋放外泌體，同時這些外泌體包含炎症細胞因子白細胞介素1β，誘導炎症反應。

在此應激條件下，星形膠質細胞會釋放含有突觸小泡相關的具有神經元特異性的磷酸蛋白質———突觸蛋白的外泌體。同時，少突膠質細胞來源外泌體內含髓磷脂和應激蛋白質。

外泌體通過遞送這些mRNA和蛋白質，在損傷神經再生方面發揮重要功能。

Zhang等發現間充質幹細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來源外泌體可通過減輕炎症反應並且促進血管新生和神經發生，從而有效促進創傷性顱腦損傷（traumitic brain injury，TBI）大鼠的功能恢復；Xin等的研究結果同樣表明，MSCs來源外泌體可通過促進神經血管再生來改善神經功能。其後，又陸續有研究證明MSCs來源外泌體在腦卒中與腦損傷動物模型中的治療效益，並發現其有明顯改善運動協調的功能和大幅度保留空間學習的能力。

4.外泌體與神經血管單元

神經血管單元是由內皮細胞、血管平滑肌、神經膠質細胞、神經元及相關組織基質蛋白組成的，卒中後的內源性腦修復涉及到神經血管單元及神經幹細胞一系列高度精密的交叉式反應，如血管再生和神經發生等，它們共同協調神經修復。外泌體在這一系列過程中發揮巨大作用。

4.1外泌體與神經再生

神經元與膠質細胞來源外泌體能夠調節神經元和膠質細胞之間的細胞信號轉導，影響軸突生長和髓鞘形成。皮質神經元外泌體攜帶有L1細胞黏附分子和穀氨酸受體2/3亞基，胞內Ca2+水平增加會促進外泌體的分泌。當去極化神經元的神經突分泌外泌體時，會使外泌體內富含微管相關蛋白1b和神經突重塑相關的靶向miRNA。此外，神經元來源外泌體內有α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受體，AMPA受體的激活有助於腦卒中後運動功能的復原。

在成人中樞神經系統中，抑制神經元第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）信號與減少星形膠質細胞疤痕，有助於提高脊柱損傷及腦卒中後軸突出芽。Goncalves等發現，視黃酸受體β激動劑能使神經元細胞分泌富含PTEN蛋白的外泌體，這些外泌體能抑制皮質神經元PTEN信號通路；轉運PTEN蛋白至膠質細胞，可抑制膠質細胞的增殖，對神經元及膠質細胞產生雙重影響。Morel等進一步證實，皮質神經元外泌體轉運mi-RNA-124至膠質細胞，提高穀氨酸轉運體1的表達，從而調節膠質細胞功能。這些數據表明，神經元來源外泌體通過轉運囊泡內活性物質，並與膠質細胞胞間信號轉導，從而調節突觸和軸突重塑。

4.2外泌體與血管新生

Notch信號通路與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路的相互作用對介導血管再生和維持腦血管屏障完整至關重要。激活腦血管內皮細胞與周細胞內Notch通路，可促使腦血管再生並維持腦血管屏障的完整性。Yamamoto等發現，由小鼠腦血管內皮細胞分泌的外泌體，能增加受體細胞周細胞內VEGF-B的mRNA與蛋白表達水平，通過VEGF-B與受體VEGFR-1介導血管再生。

研究發現人腦微血管內皮細胞與人臍靜脈內皮細胞來源的外泌體內含Delta-like ligand 4（Dll4）蛋白，Dll4能刺激周細胞上的Notch3受體，並保護腦血管結構穩定及調節血管再生。以上結果表明，腦血管內皮細胞外泌體通過傳遞生物信號至周細胞，並通過VEGF和Notch信號通路介導血管再生和維持腦血管屏障完整。Haqqani等發現，人腦微血管內皮細胞來源的外泌體內至少含有1179種蛋白，其中包括約60種標記蛋白，如Alix、TSG101、CD81和CD9等，同時，他們進一步發現，這些外泌體能夠攜帶大分子蛋白穿越血腦屏障，其中包括轉鐵蛋白受體、胰島素受體、LRP、LDL和TMEM30A等。

此外，Skog等發現，膠質母細胞瘤分泌的外泌體富含促血管生成蛋白，而腦微血管內皮細胞可以吸收這些外泌體，從而誘導血管新生。

5.外泌體在腦卒中的研究進展

近年來，隨著對外泌體研究的深入，已證實外泌體調控的細胞間信息交流過程也廣泛參與了腦血管系統的生理、病理過程，並在腦卒中疾病發生髮展機制中扮演著重要的角色。Chen等通過收集急性腦卒中病人的血樣本後分析發現，與陰性對照組相比，缺血組外泌體內miRNA-223含量顯著上調，並且外泌體內miRNA-223的表達量與急性腦卒中的發生、嚴重程度及短期預後相關。

血漿內皮細胞來源的外泌體（plasma endothelial cell-derived exosomes，EDEs）富含內皮細胞蛋白血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和內皮型一氧化氮合酶；具有內皮細胞特性，可以黏附、募集單核細胞引起炎症反應，提示EDEs在細胞炎症反應中起重要作用；有研究發現腦血管疾病的病人EDEs內VCAM-1、血管性血友病因子、血小板源生長因子BB、血管生成素1、賴氨酰氧化酶2以及腦血管選擇性蛋白葡萄糖載體1等較對照組顯著增高，這表明EDEs與腦血管疾病有著某種潛在聯繫。

目前，

體內外實驗均已證實MSCs外泌體在腦卒中後腦重塑中的治療效益，外泌體能夠呈遞MSCs內的miRNA至受體細胞。目前已發現有超過700種miRNA在MSCs分泌的外泌體中，這些miRNA能與RNA誘導沉默複合體組件AGO2結合。Xin等發現，在缺血腦組織中miRNA-133b水平顯著降低，然而，miRNA-133b能靶向調節結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和Ras基因家族成員A，從而促進軸突生長；同時，他們發現MSCs治療能上調缺血腦組織中的miRNA-133b水平，並且，體內實驗表明，MSCs與缺血腦細胞共同培養會促進MSCs分泌富含miRNA-133b的外泌體；此外，他們運用慢病毒轉染技術分別製造miRNA-133b高、低表達的特異性外泌體，並發現相比於單純給予未處理的MSCs外泌體，高表達和低表達miRNA-133b，分別能促進和抑制大鼠軸突重建與神經功能的恢復；高表達miRNA-133b外泌體抑制星形膠質細胞內CTGF表達，並促進皮質神經元神經突生長。

我們課題組通過體外實驗發現，人臍靜脈內皮細胞來源的外泌體能改變缺氧神經細胞內相關凋亡蛋白Bax、caspase-3、Bcl-2的表達，同時促進細胞增殖、侵襲和遷移，從而協助神經細胞抵抗缺血再灌注損傷。另外，腦卒中會誘導外周血的免疫抑制，從而抑制神經功能的恢復，研究發現，MSCs外泌體除了與腦細胞相互作用，還能在外周血中與自然殺傷細胞和淋巴細胞相互作用，從而減弱缺血後的免疫抑制。

6.小結與展望

腦卒中後，外泌體在神經保護和神經功能修復這一系列過程中涉及到多種胞間信號通路的精密調控，神經血管單元的重建對神經功能修復有著舉足輕重的影響；外泌體通過胞間信號溝通，靶向調節多種胞間信號通路，在調節腦卒中後的神經功能恢復中，具有巨大潛能。然而，有關腦卒中領域中外泌體的研究仍存在許多未知性，例如，腦卒中後，腦實質細胞或者遠程器官如何通過細胞信號通路影響外泌體的分泌以及其內物質的改變，外泌體如何調控受體細胞內源性基因的表達等，這些問題都等待著我們一一探究。

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