在多細胞生物中，幾乎所有的mRNA前體(pre-mRNA)的3’端加工都是通過核酸內切酶在特異性位點的切割和在該位點添加poly(A) 尾兩個步驟完成的。但是
複製依賴型組蛋白(replication-dependent histone) pre-mRNA是個特殊的類別，這些蛋白是核小體(nucleosome)的重要組成部分，僅在細胞週期的S期快速大量表達以包裹新複製合成的DNA，與經典的以poly(A) 結尾的mRNA不同，組蛋白 mRNA是以一段保守的莖-環結構(stem-loop)作為其成熟mRNA的3’末端【1】。兩者採用不同的3’端加工機器，然而，進化中負責切割兩種pre-mRNA的蛋白質模塊卻是相同的。該模塊由核酸內切酶CPSF73，其同源蛋白CPSF100，腳手架蛋白Symplekin和切割促進因子CstF64組成，該模塊在組蛋白通路中被稱作HCC (histone pre-mRNA cleavage complex)，在經典poly(A) 通路中被稱作mCF (mammalian cleavage factor)。核酸內切酶的活性在體內需要受到精確的調控，因此HCC/mCF模塊在兩條通路中均需要多個輔助蛋白的參與來幫助其識別正確的pre-mRNA底物以及誘發核酸內切酶CPSF73的激活。但至今對於HCC/mCF 如何催化切割pre-mRNA以及與輔助蛋白之間如何互作的分子機制依然知之甚少。美國哥倫比亞大學童亮研究組曾在2006年解析了核酸內切酶CPSF73 閉合狀態的晶體結構【2】，並且多年來一直從事對 pre-mRNA 不同類型3’端加工機器的結構生物學研究。近年，童亮研究組與洛克菲勒大學Thomas Walz研究組合作利用冷凍電鏡技術(Cryo-EM) 闡明瞭人類pre-mRNA 3’端加工經典通路中poly(A) 信號AAUAAA的識別機制【3】和重要蛋白模塊的組裝機制
【4】（詳見BioArt報道：Mol Cell | 童亮課題組等揭示pre-mRNA的3’端加工機制）。研究發現mCF/HCC自身結構高度動態，推測mCF 必須進行一系列的結構重排，才能實現對RNA的切割。為了揭開mCF/HCC激活機制的謎題, 2020年2月7日，童亮研究組， Thomas Walz研究組和北卡羅來納大學教堂山分校的William Marzluff研究組合作在Science發表論文，題為：Structure of an active human histone pre-mRNA 3'-end processing machinery。研究人員利用13個重組蛋白和兩條RNA重構出具有切割活性的人類組蛋白pre-mRNA 3’端加工機器，並且解析了催化狀態下複合物的冷凍電鏡結構（圖1）。結構揭示出不同蛋白之間精細地協同互作，從而實現核酸內切酶CPSF73精確切割RNA的分子機制，很好的解釋了大量生化和功能實驗中的數據，並且對於經典通路pre-mRNA和snRNA 3’端加工有重要的提示作用。
圖1人類組蛋白pre-mRNA 3’端加工機器的結構
人類組蛋白pre-mRNA 3’端加工機器由HCC，U7 snRNP (small nuclear ribonucleoproteins), FLASH和莖環結構結合蛋白SLBP (stem-loop binding protein)組成，組蛋白pre-mRNA作為其底物（圖1）。3’端加工位點位於保守的莖環結構SL(stem-loop)和組蛋白pre-mRNA下游序列元件HDE (histone down stream element)之間。SLBP蛋白可以特異性識別該莖環結構【5】。
在樣品的製作過程中，研究人員通過低溫來減慢3’端加工的進程，並且收集大量冷凍電鏡數據，仔細分類，從中成功捕捉到pre-mRNA位於核酸內切酶CPSF73活性位點，準備被切割的狀態，即核心部分(core) 3.2 Å的冷凍電鏡結構（圖1）。結構解釋了3’端加工位點具有腺嘌呤特異性的原因，並闡明CPSF73切割RNA的分子機制。
結構顯示，HDE與U7 snRNA形成RNA雙螺旋，HCC中Symplekin N端結構域、CPSF100的β-CASP結構域和CPSF73的metallo-β-lactamase結構域從三個側面對該雙螺旋識別，使原本處於高度動態的HCC發生結構重排（圖2）。研究人員指出該識別是HCC和CPSF73激活的關鍵性起始步驟，
值得注意的是，與閉合狀態的CPSF73相比，其β-CASP結構域相對於 metallo-β-lactamase結構域發生了17o的旋轉，從而產生可以容納單鏈RNA的“狹縫”，實現切割。結構對比發現 U7 snRNP中的Lsm10，其保守的N和C端與關閉狀態的CPSF73 β-CASP結構域存在空間位阻，且Lsm10的C端部分位於“狹縫”的邊緣，與底物有相互作用
（圖2）。研究人員推測Lsm10是誘發CPSF73激活的關鍵蛋白。HCC識別HDE-U7雙螺旋發生結構重排後，迫使CPSF73與Lsm10靠近，Lsm10引起CPSF73結構域的重排。
圖2 HCC和CPSF73 的活性狀態
在核心部分 3.2 Å的結構中，研究人員發現並沒有屬於FLASH和SLBP蛋白的密度圖，但功能實驗表明這兩個蛋白的缺失會影響組蛋白pre-mRNA 3’端加工機器的激活，所以研究人員對該核心部分結構進一步分類，解得複合物整體4.1Å的冷凍電鏡結構
（圖1）。結構結合生化實驗顯示FLASH形成長80Å的coiled coil結構【6】，連接HCC中symplekin C端結構域、SLBP-莖環結構和U7 snRNP中的Lsm11，幫助協調拉近各個組份，進而幫助底物成功進入CPSF73激活產生的“狹縫”中。人類組蛋白pre-mRNA 3’端加工機器催化狀態的結構揭示了其組裝和激活機制。結合生化數據，研究人員提出了組蛋白pre-mRNA 加工循環（圖3）：U7 snRNP(步驟I)結合FLASH(II)，隨後招募HCC(III)，在結合底物pre-mRNA之前，整個加工機器高度動態，伴隨著對pre-mRNA的識別，HCC和CPSF73激活(IV，即本文結構)，切割後(V)，5’端產物釋放，3’端產物被核酸外切酶降解，蛋白複合物進入下一個切割循環。
圖3組蛋白pre-mRNA 加工循環
美國哥倫比亞大學童亮研究組的孫亞東博士和洛克菲勒大學Thomas Walz研究組的張一小博士為該論文的共同第一作者。
原文鏈接：
https://science.sciencemag.org/content/367/6478/700
製版人：小嫻子
參考文獻
1, Dominski Z., Marzluff WF. (2007) Formation of the 3' end of histonemRNA: getting closer to the end. Gene 396, 373-390.
2, Mandel, C.R., Kaneko, S., Zhang, H., Gebauer, D., Vethantham,V., Manley, J.L., and Tong, L. (2006). Polyadenylation factor CPSF-73 is thepre-mRNA 3'-end-processing endonuclease. Nature 444, 953-956.
3, Sun, Y., Zhang, Y.,Hamilton, K., Manley, JL, Shi, Y., Walz, T., and Tong, L. (2018). Molecularbasis for the recognition of the human AAUAAA polyadenylation signal. Proc NatlAcad Sci USA 115, E1419-E1428. (Epub Dec. 5, (2017))
4, Zhang Y, Sun Y, Shi Y,Walz T, Tong L. (2019) Structuralinsights into the human pre-mRNA 3'-end processing machinery. Molecular Cell. 2019 Nov 25 (Epub ahead of print)
5, Tan D., Marzluff WF.,Dominski Z., Tong L., Structure of histone mRNA stem-loop, humanstem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science 339, 318-321(2013).
6, Aik WS et al., TheN-terminal domains of FLASH and Lsm11 form a 2:1 heterotrimer for histonepre-mRNA 3'-end processing. PLoS One 12, e0186034 (2017).
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