顧名思義，核糖核蛋白（RNP）顆粒是存在於細胞核和細胞質中的RNA和蛋白質的動態組裝體。 每種RNP顆粒，由於其成分，材料特性（例如表面張力，彈性和粘度），形態，亞細胞定位和功能的不同，具有不同的特性。當分散在基質中的RNA和蛋白質聚集成濃縮狀態（濃縮相）時，就會發生液-液相分離(liquid-liquidphase separation, LLPS)。在這種濃縮相中，高度濃縮的RNA和RNA結合蛋白（RBP）形成“無膜細胞器”，能與周圍的核質或細胞質保持物質的動態平衡，並可能瞬時完成濃縮相和分散相的切換。這些參與形成LLPS的RBP都有個共同特徵：具有低複雜度域（lowcomplexity domain, LCD）, 在體外會形成濃度依賴性的LLPS。每種RNP顆粒都包含多個RBP, 然而，尚不清楚單個RBP的LLPS如何與其他數百個相似的RBP組成的LLPS聚合成一個RNP顆粒。值得注意的是，在體外敲掉某個RBP對它所屬的RNP顆粒的組裝沒有明顯的影響。
脅迫應答顆粒（stressgranule, SG）是RNP顆粒的一種突出類型，是真核細胞細胞質中為了應對多種應激源而形成的“無膜細胞器”。SG組裝與翻譯起始的阻滯相關，伴隨著多核糖體的分解和未包被的mRNA的細胞質濃度的升高。蛋白質組學分析和空間蛋白質組學等發現數百種不同的蛋白質和數千種不同的RNA是SG的組成成分，但尚未有研究揭示SG組裝的機制或單個成分的相對貢獻。儘管RNA自組裝有助於SG組裝，但證據也表明RBP也起著重要作用，如TIA1，HDAC6，G3BP1和G3BP2，PRRC2C，CSDE1和UBAP2L。然而，這些蛋白質的相對重要性以及它們如何相互關聯以調控裝配的機制未見報道。
來自美國聖裘德兒童研究醫院的J. PaulTaylor研究組在Cell 發表了題目為G3BP1 Is aTunable Switch that Triggers Phase Separation to Assemble Stress Granules的文章，為我們詳細解析了單個蛋白G3BP1在SG調控裝配中的核心作用。
楊培國博士（第一作者）等人對人類全基因組21,121個基因 進行了RNAi篩選，鑑定出210個影響SG組裝的RBP。SG組裝與否（scoring）是通過在熱激條件下，觀測免疫染色SG marker蛋白eIF3h來實現的。通過與之前Roy Parker小組發表的SG組成成分以及相關數據庫的比對，將研究範圍進一步縮小到一個含有36個蛋白的核心SG網絡。這些蛋白與RNA相互作用形成網絡，當此網絡的集體交互突破閾值飽和濃度時，便會發生LLPS，形成SG組裝的“種子”。LLPS的驅動力在整個網絡中分佈不均，對這36個蛋白逐一敲除發現，只有G3BP1/2雙敲之後能夠能夠完全抑制SG的形成，確定G3BP1/2是該網絡內中心度最高的“節點”，對於SG組裝至關重要。
鑑於G3BP1和G3BP2的高度相似性，他們以G3BP1為例，通過體外實驗檢測其相變的調控機制，發現G3BP1本身在生理鹽濃度下並不發生相分離，RNA可以促進其相分離。mRNA以及單鏈RNA可以促進G3BP1相分離，而tRNA或者雙鏈RNA則不能。RNA的長度也起到作用，小於250nt的RNA基本不再促進相分離。進一步的生物物理實驗表明，多價位的（multivalency）RNA是形成SG的必要條件。
分子生物學實驗揭示出G3BP1的N-端NTF2L結構域(二聚體，PDB)是SG形成所必須的，而C-端RNA結合區域（RBD）是相分離所必須的。將G3BP的NTF2結構域替換成其他的二聚體結構域（GST，FKBP(F36M)）發現，他們也具有不同程度的SG組裝能力，說明NTF2結構域可能通過與其他SG蛋白組分（如Caprin1）相互作用進而調控G3BP1的相分離。例如，Caprin1是G3BP1核心網絡的成員之一，儘管其SG的形成是非必須的，但是可以大大地促進G3BP1的相分離。在細胞內過表達Caprin1可以降低細胞形成SG所需的G3BP的閾值濃度（thresholdconcentration）。G3BP1中間的兩個酸性結構域（IDR1/2）可以調節G3BP1在細胞的可溶性（solubility），並調控部分蛋白被募集到SG的能力。此外，其S149位的磷酸化在一定程度上調控了SG的組裝過程。
總之，該文詳細闡述了G3BP調節SG形成的分子機制，揭示了單一蛋白的相變在調控多組分RNP聚集體的形成的作用，對於細胞內其他的無膜細胞器的形成具有重大啟示意義。同時，這些研究也為各無膜細胞器之間的共存及互相調控提供了新的模型及研究思路。
啟發與問題：
1.該文的前期工作核心是在熱激條件下，觀測免疫染色SG marker蛋白eIF3h表達與否來實現RNAi篩選。這個工作量是巨大的，所選的maker也必定是兼具特異性和敏感性的。好奇的是1），這210個RBP是如何，在什麼水平調控eIF3h表達的？2）HP1有CSD, G3BP有NTF2，其他蛋白（如本文的210個）都有形成寡聚體的結構域嗎？3)如果我們想做類似的文章，如nucleoli,Cajal bodies, speckles, paaspeckles, etc, 我們如何找到這個特異的marker？
2. G3BP1和G3BP2是高度相似的，做RNAi來特異性敲除的時候，這個實驗的設計有什麼需要特別注意的地方？
3. G3BP1/2的分子量在52kD左右，本文的使用濃度有時高達200 uM，即10.4 mg/ml，這個量真是很高了，都可以做結晶了吧。這兩個蛋白的NTF2 domain 已經有晶體結構了，然而RBD domain 還沒有，有人跟進嗎？要想解析RBDdomain與RNA的複合結構，需要在設計RNA上下一番功夫吧？
4. GST是二聚體。用它做蛋白表達的親和tag的時候，有可能會導致蛋白聚集。
5. 本文S149位的磷酸化並非通過體外磷酸化實現的，而是通過突變來模擬磷酸化的。
6. 寫作上，本文依然是一步一步從現象揭示本質，具有很強的邏輯性。
參考消息：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420303391
