你的身體與年齡相符嗎？讓“生命時鐘”染色體端粒告訴你答案

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編者按：從"海弗利克極限"到端粒酶基因療法，科學家對端粒與衰老關係的好奇心從未減弱。端粒一直以來都被看作是衰老的生物標誌物，然而端粒的哪些維度可以作為臨床的衰老生物指標呢，本文編譯自《The telomere world and aging: analytical challenges and future perspectives》（原作者Emanuela Mensa）將對此做介紹。該原文更注重技術分析，但是考慮到大多讀者非科研人員，這裡對於測量技術僅做概述。

端粒是真核生物染色體的終端核蛋白結構，在保護染色體DNA末端中起關鍵作用。許多證據表明，端粒除了保持染色體穩態，還參與調節基因的表達，並調控與應激相關的信號通路。

端粒長度（telomere length，TL）具有物種特異性和遺傳性。其在各時間的值取決於遺傳特徵以及"縮短"和"延長"信號間的平衡。端粒酶是一種RNA-蛋白質複合體，主要由端粒酶模板RNA（TERC）、端粒酶逆轉錄酶（TERT）和端粒相關蛋白（TEP）三部分組成。它在大多數真核細胞中負責保持"複製潛能"，並且還參與從維持端粒長度、基因組穩定性到組織更新和線粒體保護等多種功能。

端粒長度是胚胎幹細胞的代謝活性和多能性的標誌，在胚胎細胞中，端粒酶具有活性，並且可以保持端粒長度恆定；在成體幹細胞中，端粒酶只有有限的活性，僅對端粒的縮短提供部分補償；而在體細胞中，端粒酶一般沒有活性。

因此，在體細胞和機體的老化過程中，端粒的縮短率遠超延伸率。當端粒達到臨界長度時就會引起端粒功能障礙，並激活DNA損傷反應，這會導致細胞的衰老表型。

端粒長度一直以來被認為同時與細胞衰老和機體衰老密切相關（細胞衰老與機體衰老並不等同，但在兩種情況下均發現了端粒的縮短），它也被看作衰老的生物標誌物，並且是老年病發生和進展的風險因素。

近年的研究發現，一種含有端粒重複序列的非編碼RNA（telomeric repeat-containing RNA，TERRA）也參與了端粒維持機制。在體內和體外的數據中均發現了端粒長度和TERRA的負相關，對於這一現象科學家提出了兩種假設：TERRA的轉錄可以促進染色體末端5'-3'核酸酶的活性；或者端粒縮短會誘導TERRA表達，從而在短端粒中調控端粒酶的招募和活性。

由於 "端粒長度"、"TERRA"和"端粒酶活性"三個元素均表現出了衰老生物標誌物的潛質，因此關於其的測量對於抗衰老就尤為重要，對於它們的測量技術的研究有五項重點：

1）如何準確測量；

2）各技術的優缺點；

3）改進的空間；

4）與端粒長度有關的化學臨床變量與衰老和老年病的聯繫；

5）需要人類縱向研究來評估特定方式（如藥物或營養物質等）在衰老期間對端粒縮短的逆轉能力。

解決這些問題有助於更加客觀地看待端粒長度相關研究及其廣泛的成果。同時這些問題也直接制約著端粒測量在臨床上的應用。

（編者注：縱向研究是指在一段相對長的時間內對同一個或同一批"被試"進行重複的研究）

在介紹端粒長度、TERRA和端粒酶活性與衰老的關係，及基於它們的各種測量方式（這裡只涉及適用於臨床和流行病學的方法）之前，瞭解三者的細胞和亞細胞定位，有助於我們從更高的層面來評價它們的測量方式。

最近的研究強調了端粒和端粒相關序列（端粒的分子結構請參考鏈接）的一系列可能的胞內和胞外定位（如下圖所示）。

可見，端粒相關序列不僅存在於細胞核中也存在於細胞質，甚至胞外的外泌體中。因此在端粒的測量中，不同的樣本和提取方式/產品將會影響最終的測量結果。

端粒與衰老及端粒長度的測量

1、端粒與衰老

許多流行病學研究發現了端粒磨損和衰老以及一些生物數據如發病率和死亡率間的聯繫。

比如，在歐洲老年人群中發現，短的白細胞端粒是機體功能下降的獨立風險因素；也有研究表明端粒磨損與BMI增加有關，這為聯接肥胖與衰老提供了一條可能的通路。然而，這些研究中使用的大多數方法學都不在預期之內，因此得到的重要實驗參數和端粒長度之間的關係受到了質疑。

除此之外，最近的證據表明，端粒長度可能無法在老年人群中作為功能性衰老的臨床標誌物，然而它在涉及年輕人和中年人群的縱向研究中卻表現出了關鍵的作用

這些異質性恰恰表明，相比於"時間"年齡，"生物"年齡能夠更加準確地預測衰老的速度。

注：許多證據表明，不同的預測子可以反映衰老的不同方面，儘管它們之間可能本身就有聯繫。目前端粒研究最吸引人的領域是探究端粒縮短如何誘導與人類衰老相關的錶冠遺傳和基因表達的改變。多種預測子的聯用可以幫助我們更好地預測複雜的衰老進程。

越來越多的證據表明白細胞端粒長度與功能障礙相關，可是兩者間並沒有表現出線性關係，因而，"短端粒"而不是端粒長度可能可以作為衰老和老年病的信息化標誌物。儘管如此，端粒長度仍被廣泛地用作衰老生物標誌物，並被許多人努力地嘗試向臨床轉化。

然而，端粒長度從研究到臨床的應用被一些生物因素制約，包括，端粒長度對遺傳、錶冠遺傳、環境和行為因素的依賴；同時也被一些技術因素制約，包括，預分析和測量技術標準化差的問題。下面就列出一些常用的端粒長度測量技術：

2、端粒長度的測量

端粒長度的測量最常用的四大種方法分別是：

1）末端限制性片段（TRF）分析（Southern blot）；

2）熒光原位雜交技術（FISH），包括定量熒光原位雜交（Q-FISH）和流式熒光原位雜交（Flow-FISH）；

3）基於聚合酶鏈式反應（PCR）的分析技術，如，定量PCR（qPCR）、單鏈端粒長度分析（STELA），和端粒最短長度分析（TeSLA）；

4）基於全基因組測序（WGS）的分析技術。

其中末端限制性片段分析被稱作端粒長度測量的金標準，然而在臨床和流行病學研究中應用最多的方法卻是qPCR和FISH。

雖然低創的DNA採集方式被越來越多地使用，但是最常用於端粒長度檢測的樣本仍然為靜脈血。然而，對於不同樣本與端粒長度檢測值的關係目前仍然知之甚少。最近的研究發現，手指刺破乾燥血點（finger-prick dried blood spot，DBS）和唾液是微創靜脈抽血的可行替代。值得注意的是，唾液中的端粒長度值要高於全靜脈血和DBS中的值。

需要指出的是，以上所有方法的開發都基於"端粒只位於真核細胞核內"的認識，然而，通過前面的說明，我們現在知道這個認識是錯誤的，因此，如何開發對核外或胞外的端粒長度的測量方式是一個新的挑戰。

TERRA與衰老及TERRA的測量

1、TERRA與衰老

研究發現，通過與DNA結合，一種含有端粒重複序列的非編碼RNA （TERRA）會特異性地在短端粒末端聚集，標記這些端粒需要修復，從而參與端粒長度的維持。在長端粒中TERRA的結合會被Rat1和RNase H2迅速移除，從而不會使長端粒延伸。【1】

在過去十年裡，TERRA的基因位點一直是端粒生物學中懸而未決的問題。新觀點認為，

在人的血液和血清中還檢測到了無細胞TERRA（cf-TERRA）序列，主要在外泌體中。另外在人腫瘤組織中檢測到了高水平的TERRA，因此TERRA可能被用於新的癌症標誌物。

值得注意的是，TERRA在染色體末端形成RNA:DNA雜合體，並摺疊成為G-四鏈體（對比通常DNA為雙鏈結構）。

G-四鏈體

最近的研究表明，癌基因和端粒DNA啟動子區域的G-四鏈體單元可能是癌症患者中的治療靶標。

2、TERRA的測量

TERRA測量最常用的方法有：

1）RT-qPCR；

2）RNA印跡（Northern blot）；

3）RNA斑點雜交（RNA dot blot）；

4）使用特異性抗體的G-四鏈體檢測。

TERRA測量面臨的最大問題就是轉錄可以從所有染色體的亞端粒區域開始。 為了解決這一問題，許多針對不同亞端粒區域的特異性引物被使用，包括匹配以下染色體的引物：1q、2q、3p、7p、10p、10q、12q、13q、14q、15q、17p、17q、18p、XqYq和XpYp。其中一些位點似乎比其它位點與TERRA的轉錄更相關。20q和Xp染色體被認為是TERRA在人細胞中最主要的位點。

端粒酶活性與衰老及端粒酶活性的測量

1、端粒酶活性與衰老

端粒酶是唯一一種可以延長端粒的酶。與其它的酶類不同，它自帶一段單鏈端粒模板（TERC）。

由於端粒酶活性在80-90%的腫瘤細胞中可見，因此它作為診斷/預後的腫瘤標誌物的價值促使了可靠和標準化的檢測方案的發展。

然而，端粒酶在正常衰老細胞中的作用尚未得到深入研究。在成人真皮成纖維細胞（HDFS）的衰老原代培養中，端粒酶逆轉錄酶（TERT）水平降低，端粒酶活性減少。

端粒酶的活化或替換具有治療端粒維持缺陷綜合症患者的潛力，另外對其進行組織工程化設計，具有治療與正常衰老相關的退行性疾病的潛力。在端粒功能障礙小鼠模型中發現，端粒酶的再活化延長了端粒長度，減少了DNA損傷信號通路，並且消除了多器官的退行表型。

另一方面，臨床研究也聚焦於通過抑制端粒酶的腫瘤治療方案。因為大多數體細胞的端粒酶活性較低，因此端粒酶在癌細胞中的選擇性失活並不會影響大多數正常細胞，這表明端粒酶是腫瘤治療的良好靶點。

端粒酶活性也被認為是心血管老化和心血管疾病的生物標誌物。最近的研究表明他汀類藥物與端粒生物學之間存在聯繫，這可能是因為他汀類藥物的抗炎作用。

2、端粒酶活性的測量

端粒酶活性的分析方法可分為兩類：一是基於直接測量端粒酶的產品，另一是基於產品擴增的不同系統。

前者包括放射性標記底物直接摻入法檢測端粒酶活性（主要問題：放射性物質使用時的複雜性和危險性）；後者包括端粒重複擴增法（TRAP）

基於直接測量端粒酶的產品的新生物分析方法包括無PCR檢測（PCR-free assays）、等溫擴增（isothermal amplification）和單分子隨機結合試驗（Single Molecule Stochastic Binding assay），這些方法不僅應用於細胞和組織端粒酶活性的檢測，也應用於體液。

多種方法也被提出應用於分析端粒酶基因活性，包括TERT選擇性剪接、TERT基因擴增和表觀遺傳改變。

有關端粒的生物變量

一些生物變量也與端粒的指標相關，比如年齡、性別和種族被發現與端粒長度顯著相關，例如，女性和非洲或西班牙裔就比男性和歐洲人更傾向於有較長的端粒。

除此之外，白細胞端粒長度和血液參數之間被發現有弱相關；炎症和端粒磨損顯著相關；吸菸、體重增加也與端粒磨損有關；長端粒與多種癌症風險相關，然而，綜合數據表明短端粒與癌症患者較差的預後相關。

尖端技術的端粒長度、TERRA和端粒酶活性測量技術仍處於起步階段，但通過方法的改進，和越來越多的提供相關服務的實驗室，我們相信它會有一個光明的未來。

技術的進步預期能夠使我們能夠在統一樣本中快速、自動化的進行標準化端粒長度、TERRA和端粒酶活性的測量，且樣本應不侷限於細胞和組織，還將包括體液和循環囊泡。預計這些新技術將在有關衰老本身和一些老年病相關的研究中提供更一致的數據。

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關鍵字: 遺傳 端粒 真核生物