撰文 | 陳文強 (哈佛醫學院博士後)
氧氣是絕大部分已知生物化學反應所共同使用的底物，其重要性甚至超過ATP及NADH【1】。在漫長的進化過程中，光合作用帶來的氧濃度上升是地球生態環境改變的重要轉折點。氧能促進多種多樣的化學反應，同時也能給末端電子受體提供能量。然而，氧濃度增加也能帶來有毒自由基的產生。因此，氧濃度的益害平衡對不同生命形式能產生顯著進化壓力。
人體細胞能感受並適應不同氧濃度變化。人類的生存環境可從海平面21%的氧環境到海拔四千多米11%的氧環境，也能在珠穆朗瑪峰5%氧濃度的大氣環境下呼吸。進化過程中，高海拔人群中存在適應性通路的遺傳選擇，而大部分這些研究都集中在經典的vHL-PHD-HIF氧感受通路，這也是自然選擇的例子之一。有意思的是，即使在同一海拔水平，血氧濃度能從動脈(100mmHg)顯著降到靜脈(40mmHg)水平，這提示人體存在特定的細胞程序來調控氧濃度波動。
過去，關於氧張力 (oxygen tensions) 的大部分研究都集中在缺氧誘導因子 (HIF)和活性氧自由基 (ROS) 途徑。而我們對於感受氧張力變化的人體基因及通路的細胞分子程序瞭解不清。
為回答這個問題，2020年4月6日，來自美國哈佛大學醫學院、霍華德休斯醫學研究所、Broad研究所及麻省總醫院Vamsi Mootha實驗室的研究人員在Cell雜誌上在線發表了題為Genetic screen for cell fitness in high or low oxygen highlights mitochondrial and lipid metabolism的研究論文，通過CRISPR篩選技術，系統鑑定了人體基因和通路水平對高低氧環境(即21%、5%及1%O2)的細胞健康(cell fitness)水平的變化，揭示了參與氧感受、代謝的基因及通路 (圖1)。
圖1. CRISPR篩選鑑定出參與適應氧張力的基因
人體不同組織的氧濃度可從大腸內腔不到1%的氧濃度到氣管21%的氧濃度。因此，本文主要集中在1%、5%及21%的氧濃度進行研究 (圖2A)。圖2B表示的是本文的遺傳篩選方法。研究人員使用Brunello庫所含的2萬個基因、近8萬gRNA對K562 KO細胞進行15天的篩選，通過基因集富集分析發現，選擇性感應高氧張力的基因集主要是線粒體氧化磷酸化途徑，而感應低氧張力的主要基因集是過氧化物酶體途徑。
圖2. 本文通過全基因組的遺傳篩選鑑定出了感應氧濃度的重要基因
一個顯而易見的問題是，經典的低氧適應通路是否在研究人員的CRISPR篩選數據庫中富集呢？通過對比此前報道的西藏高海拔人群的基因組特徵，研究人員並未發現這些基因及HIF通路靶基因在本篩選的數據庫中富集【2】。隨後，研究人員發現，在213個21%氧濃度富集的基因中，76個與孟德爾疾病相關 (圖3A) ，其中52個基因與線粒體疾病相關，包括丙酮酸脫氫酶缺乏症 (PDH)、顯性遺傳視神經萎縮 (OPA1)、腓骨肌萎縮症 (MFN2)、鐵粒幼細胞性貧血 (GLRX5)及巴特綜合徵 (TAZ)。這些篩選結果需要通過進一步的臨床前實驗來證實低氧的益處。
圖3. 線粒體基因對高氧水平選擇性表達
研究人員也發現了特定線粒體途徑選擇性富集於高氧環境，包括呼吸鏈複合物I、丙酮酸脫氫酶複合物 (PDH)、線粒體丙酮酸轉運體 (MPC)、2型脂肪酸合成 (FASII)、輔酶Q生物合成及鐵硫團簇 (Fe-S) 生物合成等，隨後，通過HEK293 KO細胞系進行了實驗驗證。
除了線粒體相關基因，研究人員也發現了低氧水平下脂代謝相關基因的選擇性參與 (圖4) 。細胞膜流動性受脂質組成、溫度及氧濃度所動態影響。常氧狀況下，細胞膜流動性主要通過不飽和脂肪酸產生來維持。去飽和酶 (desaturase enzyme) 為氧依賴性的，而硬脂酰輔酶A去飽和酶 (SCD) 可降低不飽和/飽和脂肪酸的比率，從而通過增加細胞膜剛度致細胞生長損傷。本研究鑑定出了調節不飽和脂肪酸生成和膜剛度的重要基因，包括AMFR、SREBF1，均為脂質代謝的重要調控因子。此外，通過檢測和過氧化物酶相關的基因，研究人員鑑定出了低氧水平下選擇性表達的過氧化物酶合成基因：PEX、ACSL4等
(圖4)。
圖4. 過氧化物酶體基因對低氧水平選擇性表達
為驗證這些脂代謝和過氧化物酶生物合成相關基因是否通過低氧的已知效應影響膜流動性，研究人員使用過氧化物酶KO的HEK293細胞系，在不同氧濃度下暴露於飽和或不飽和脂肪酸，發現
不飽和脂肪酸的添加可逆轉低氧誘導的細胞生長損傷 (圖5)。
圖5. 不同氧張力條件下，使用飽和和不飽和脂肪酸處理HEK293 WT及KO細胞系
最後，研究人員想要回答的問題是，低氧是否會促進過氧化物酶體來源的脂質生成？對K562細胞系進行脂質組學，研究人員在WT和PEX KO細胞系裡檢測了454個已知的脂質種類，發現暴露於24小時低氧狀態的細胞產生更多的飽和脂質。在21中檢測的脂類中，溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE) 和溶血磷脂酰膽鹼(LPC)的升高尤其顯著；而44中過氧化物酶體來源的脂類中，8中在低氧狀態下顯著升高
(圖6) 。
圖6. 低氧狀態下，過氧化物酶體脂質合成增加
總體而言 ，本文通過CRISPR篩選及後續驗證實驗，揭示了過氧化物酶體的代謝在維持膜流動性的作用。此前的研究提示，在缺氧狀態下，抑制SCD帶來的毒性可以通過兩種機制緩衝：脂質液滴形成【3】 及溶血磷脂清除【4】。而本文提示了第三種機制——過氧化物酶醚脂合成可減輕細胞膜剛性應激 (membrane rigidity stress)。
圖7. 本文模型：低氧狀態下SCD產生的毒性可通過三種機制得到緩衝：(1)脂質液滴形成；(2)溶血磷脂清除；及(3
綜上所述，本文所提供的CRISPR篩選資源信息，為我們提供了遺傳疾病的另一種研究角度，即這些遺傳疾病的嚴重程度可通過氧水平及與氧穩態相關的成百上千的基因所關聯。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.029
參考文獻
1. Raymond, J., and Segre, D. (2006). The effect of oxygen on biochemical networks and the evolution of complex life. Science 311, 1764–1767.
2. Yang, J., Jin, Z.B., Chen, J., Huang, X.F., Li, X.M., Liang, Y.B., Mao, J.Y., Chen, X., Zheng, Z., Bakshi, A., et al. (2017). Genetic signatures of high-altitude adaptation in Tibetans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, 4189–4194.
3. Piccolis, M., Bond, L.M., Kampmann, M., Pulimeno, P., Chitraju, C., Jayson, C.B.K., Vaites, L.P., Boland, S., Lai, Z.W., Gabriel, K.R., et al. (2019). Probing the Global Cellular Responses to Lipotoxicity Caused by Saturated Fatty Acids. Mol. Cell 74, 32–44.
4. Kamphorst, J.J., Cross, J.R., Fan, J., de Stanchina, E., Mathew, R., White, E.P., Thompson, C.B., and Rabinowitz, J.D. (2013). Hypoxic and Ras-transformed cells support growth by scavenging unsaturated fatty acids from lysophospholipids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 8882–8887.
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