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上一講我們說了怎麼做石蠟切片，這一講我們繼續說說怎麼做冰凍切片。
冰凍切片
如果說石蠟切片可以切得很豪放，那麼冰凍切片做起來就比較受限制了，受什麼限制呢？答案是：溫度。我們從字面來看，冰凍切片，當然需要溫度比較低，一般用零下20℃（-20℃）。所以做冰凍切片第一個準備工作就是打開冰凍切片機預冷。在切片機預冷的一兩個小時裡，我們可以做其他的準備工作，包括：刀片、載玻片（防脫）、O.C.T.膠、鑷子、捲紙、鉛筆（這裡有個重要的小動作，請參見小貼士1）。請記得把刀片和鑷子也放到切片機裡面預冷，但是，載玻片，不！要！放！本俠解釋一下原因，刀片、鑷子和載玻片都是要直接接觸O.C.T.膠的，O.C.T.膠常溫時呈液態而-20℃時呈固態，而上上講（沒寫錯，就是上上講）裡面我們也說過O.C.T.膠是用來裹在組織外面幫助切片成型的，所以我們希望的理想狀態是，刀片和鑷子在切片時接觸O.C.T.膠可以保持膠的固態以保證順利切片，而載玻片在貼片時接觸O.C.T.膠可以瞬間將膠融化為液態以幫助組織迅速貼到載玻片上。所以為了實現這個理想，我們要將刀片和鑷子的溫度也預冷到-20℃，而將載玻片保持常溫。
圖 1
待冰凍切片機預冷完畢，首先穿上一件長袖、較厚的白大褂，尤其是夏天，因為我們的兩隻胳膊是要伸進切片機-20℃區域操作，而且時長一般是以小時計的。做好保護工作，再把組織從冰箱取出來，放進切片機保持低溫狀態。冷凍切片第一步，把組織固定到冷凍頭上。首先取一個你中意的冷凍頭（冷凍頭一般有好幾個，長相如圖2所示），接下來有個操作，本俠自己發明的，本俠為此得意了好幾年，現在本俠無私地公開給所有粉絲，那就是在冷凍頭上夾一個自制O.C.T.膠成型器（這個神器怎麼做，請參見小貼士2，神器長相如圖3所示）。這個成型器有什麼用呢？容本俠解釋。由於組織和冷凍頭都是固體，所以我們想把組織固定到凍頭上，必須藉助液態的O.C.T.膠把組織“粘”到冷凍頭上。這一步的具體操作是把組織用鑷子夾到冷凍頭上，然後擠點O.C.T.膠將組織完全淹沒，然後把冷凍頭放回冷凍頭架上，耐心等待O.C.T.膠凝固。一旦O.C.T.膠完全凝固，這一步操作就完成了。說了半天好像也用不上O.C.T.膠成型器呀，表急。由於O.C.T.膠是凝膠狀的，所以它被擠到冷凍頭上時邊緣是不規則 的，這就導致切片的時候不易形成規則且完整形狀而導致切片不那麼順利。所以這時如果用上一個O.C.T.膠成型器，我們就能得到一張張邊緣整齊的圓形切片，就像方形的石蠟切片那樣完美。
圖2 冷凍頭
圖3 O.C.T.膠成型器
準備好標本，把冷凍頭連標本固定在切片機上，安裝刀片（注意事項可參考石蠟切片），開始修片。沒錯，冰凍切片同樣需要修片。修片時使用的切片厚度可以用10μm、15μm，再厚點也可以。由於冰凍切片具有易融、易裂的特點（這是本俠理解的），所以正式切片的厚度比石蠟切片略厚一些，一般用5μm ，再厚一些也是有的，有小夥伴甚至用10μm。與石蠟切片不同，冰凍切片每一片切下來都是獨立的（這裡請參見小貼士4），不會首尾相連地粘在一起，這倒是給貼片提供了方便。但是，冰凍切片的貼片步驟真正方便之處並不在此，而是冰凍切片的本質——冰凍。剛剛我們說過，O.C.T.膠常溫時呈液態而-20℃是呈固態，所以當固態的O.C.T.膠遇到常溫的載玻片時立刻融化，這個過程很自然地將組織吸在了載玻片上，於是一張冰凍切片就製作完成了。切好的冰凍切片如果不需要馬上染色，可以放到切片盒，存到-80℃直到你什麼時候想起它們。
關於切片我們就說這麼多，下一講本俠想跟大家說說怎麼做免疫組化染色。
豬豬俠小貼士
1、本俠在準備工作裡列舉的所有物品不包括冷凍頭，因為本俠默認冷凍頭是一直放在切片機裡面的。如果有小夥伴使用的切片機冷凍頭每次用完是拿出來保管的（很多公用的切片機為了防止私自使用會採取這種方法），請一定記得，預冷切片機的時候把冷凍頭也一起放進切片機預冷 ，原因同刀片和鑷子。
2、前方高能：本俠自制O.C.T.膠成型器。取一個20ml注射器，去掉針頭和注射器芯，留外面那個有刻度的管兒。請注意了，我們需要的是裝注射器芯的那頭（也就是打針的時候食指和中指接觸的那頭），而不是裝針頭的那頭，接下來找一個美工刀或者剪刀，把管兒切下2cm左右，自制O.C.T.膠成型器就做成了。最後再找兩個最小號的長尾夾，把成型器夾到冷凍頭上就可以使用了。每每想到這個神操作，本俠都忍不住暗自點贊。
3、冰凍切片機裡的多個冷凍頭其實是用來給切多個樣本節省時間的。我們用O.C.T.膠把組織“粘”到冷凍頭上，等待膠凝固其實是需要一點時間的，如果我們每次都是等切完一個組織，然後把組織拿走，再用捲紙把冷凍頭擦乾淨，接著準備下一個樣本，這樣很浪費時間，所以一般切多個組織，都是把能用的冷凍頭都用上，一次凍上一批組織，然後每切完一個，空出來一個凍頭，再凍上新的組織，這樣比較節約時間。
4、切冰凍切片跟切羊肉卷本質上一毛一樣，所以有個現象也一毛一樣，那就是切下來的
切片會成卷。所以切片機自帶了一個防卷的玻璃板，切下來的切片會自動壓到玻璃板下面變平。但是玻璃板使用久了，切下來的切片不一定能準確地插進玻璃板和刀片之間的縫隙，所以本俠直接用鑷子把切片夾下來，但是這個操作有點難度，因為是邊切邊扽，也就是刀片剛切開一點點膠的時候，鑷子就要夾住切片，然後隨著刀片繼續切，鑷子引著切片往下走，直到切片完全切下來。如果有小夥伴很悲催地遇到了不好用的玻璃板，並且同時又有點不那麼心靈手巧，那麼可以選擇任由切片成卷，等卷掉下來，用鑷子（最好是彎頭）頭插進卷裡，打開鑷子把卷撐開，然後保持鑷子撐著卷的狀態（這時卷會掛在鑷子上），把卷放到載玻片上貼片，效果也很好。5、切完的組織用PBS洗洗可以回收的，因為被切過的組織僅僅是變小了而已，組織還是那個組織，只是外面粘了點膠。
6、關於切片（包括石蠟和冰凍）的操作，本俠幾乎沒有提及關於切片機的具體操作步驟，比如切片機怎麼開機、怎麼打開刀片夾又怎麼關上、怎麼調切片厚度等等，原因是這些操作跟具體機型直接相關 ，而且如果你能找到一臺切片機使用的話，你肯定也能找到一個會使用機器的人教你怎麼用。
以上！
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