文獻速遞

癌症微生物組的系統表徵為開發可利用非人的微生物來源的分子診斷主要的人類疾病的技術提供了機會。重新分析了癌症基因組圖譜（TCGA）的全基因組和全轉錄組測序研究中從未經治療的 33 種癌症（共 18,116 個樣本）的微生物數據，在大多數主要癌症內和組織和血液之間中發現了獨特的微生物特徵。儘管在非常嚴格的去汙染條件下丟棄高達 92.3％ 總序列數據後，這些 TCGA 血液特徵對 Ia-IIc 期癌症和在兩個商業級遊離腫瘤 DNA 平臺檢測無基因組改變的癌症依舊具有可預測性。此外，僅用血漿來源的遊離微生物核酸可以區分健康，無癌症的個體（n = 69）和多種癌症患者（前列腺癌，肺癌和黑色素瘤；n = 100）

Keywords: Cancer, Diagnostic markers, machine learning, metagenomics, Microbiome

Title: Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach

DOI: 10.1038/s41586-020-2095-1

First Authors: Gregory D Poore,Evguenia Kopylova

Correspondence: Rob Knight

Affiliation: Department of Bioengineering, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Published: 2020-03-11

研究背景

癌症被認為是人類基因組的疾病，但目前已有研究表明，微生物組對某些類型的癌症有重要貢獻，尤其是糞便微生物與胃腸癌。而微生物對不同類型癌症的貢獻程度和診斷意義尚未清晰，是因為在樣品收集，處理和測序過程中引進的汙染限制這些研究。採用新的工具可以最大程度減少汙染物微生物特徵以合理開發基於微生物的診斷。

為了研究癌症與微生物組關係，重新分析了癌症基因組圖譜（TCGA）的全基因組（WGS；n = 4,831）和全轉錄組（RNA-seq, n = 13,285）測序研究中從未經治療的 33 種癌症（10,481名患者的18,116個樣本）的微生物數據

先前在胃腺癌中的 Epstein–Barr virus (EBV) 和宮頸癌中的 human papillomavirus (HPV) 中有專門研究過微生物數據，並且已經在小部分樣本中進行了系統研究，如來自 19 種癌症的 4,433個 TCGA 樣本的病毒和橫跨 9 種癌症的 1,880 個 TCGA 樣本的細菌。但大量的 TCGA 樣品的微生物數據尚未開發。

作者用兩套微生物檢測pipeline全面系統地有組織地創建全面的癌症微生物組數據集，以減少系統誤差和汙染。基於微生物特徵用機器學習（ML）來識別區分癌症類型，並比較其性能。

因為 TCGA 樣品處理過程沒有控制微生物汙染和排除健康對照。所以作者額外做了血液的分析，TCGA 樣品很有可能引入外源的微生物汙染。作者專注於血漿來源的微生物 DNA 的特徵與臨床許可遊離腫瘤 DNA（ctDNA）分析比較的基準測試。

對前列腺癌，肺癌，或皮膚癌患者和健康的，無癌症，無 HIV 的對照組的血清樣品深度宏基因測序，結果顯示遊離微生物可以區分健康對癌症或者癌症之間。

研究結果

01.TCGA癌症微生物組及其標準化

在 TCGA 中獲得 6.4×10 12 個測序讀數中，有 7.2％ 為非人類序列，其中 35.2％（佔總的2.5％）為細菌、古細菌或病毒，其中 12.6％（佔總的0.9％）用 Kraken 定位到屬水平（圖1a）。元數據質控剩下 17,625 個樣品，根據癌症類型和樣本類型進行了轉換歸一化處理（Voom-SNM）（圖1b）。在原發腫瘤（primary tumour）、實體瘤癌旁（solid tissue normal）、轉移（metastatic ）和複發性腫瘤（recurrent tumour samples）中，WGS 中的微生物數據顯著高於RNA-seq中的（圖2fg）。

由於快速 k-mer-matching 方法容易產生假陽性，因此對於四種已知與微生物有關係和/或配對蛋白質組數的TCGA類型的癌症（宮頸鱗狀細胞癌（CESC），胃腺癌（STAD），肺腺癌（LUAD），和卵巢漿液性囊腺癌（OV））進行 bwa 比對驗證，Kraken 假陽性率較低（1.09％），說明 Kraken 數據可用下游分析。

已知 TCGA 表達和人基因組數據具有批次效應。用 Voom 的對數轉換（log-cpm）和歸一化（SNM）處理（圖3-4）。主方差分量分析顯示處理後能減小效果批次同時增加生物信號（包括“疾病類型”）（圖5）。

圖1 a, Lollipop plot showing the percentage of total sequencing reads identified by the microbial-detection pipeline, and those resolved at the genus level in TCGA data set by Kraken.

b, CONSORT-style diagram showing quality control processing and the number of remaining samples. FFPE, fixed-formalin paraffin-embedded.

圖2 f, g, Microbial reads counts as normalized by the quantity of samples within a given sample type across all types of cancer in TCGA after metadata quality control (Fig. 1b), including the three major sample types analysed in the paper (f) and the remaining sample types (g).

圖3. Principal components analysis (PCA) of Voomnormalized data, with cancer microbiome samples coloured by sequencing centre. d, PCA of Voom-SNM data.

圖4. d, PCA of Voomnormalized data, where colours represent experimental strategy of the sample and each dot denotes a cancer microbiome sample. e, PCA of the data following consecutive Voom-SNM supervised normalization, as labelled by experimental strategy.

圖5. e, Principal variance components analysis of raw taxonomical count data, Voom-normalized data, and Voom-SNM data.

02.腫瘤類型內與外的預測

使用歸一化的數據，訓練了 stochastic gradient-boosting 機器學習模型，以區分不同癌症類型和癌症不同階段。模型在區分（i）一種癌症與所有其他癌症（n = 32種癌症）和（ii）癌症與正常（n = 15種癌症）性能表現很好（圖6f-g）。癌症類型之間模型的敏感性和特異性的差異部分可能是由於規模的差異所致，因為人群規模 AUROC 和 AUPR 具有顯著線性關係（圖7）。儘管這些歷史組織樣本的空間檢驗不在本研究的範圍之內，但癌症微生物的異質性也可能導致模型性能差異。模型在區分 COAD、STAD、KIRC 的 I 期和 IV 表現良好但在其餘 5 種癌症不區分不同階段。這些結果表明，對於所有類型的癌症，微生物群落結構動力學可能與宿主組織所定義的癌症階段不相關（圖6h）。

為了評估方法的通用性，將原始 TCGA 微生物數據隨機分成兩批，分別重複所有測序，其中一半獨立訓練另一半測試。在不同組合中都表現出高度相似的性能。無論是單一測序方法（WGS或RNA-seq）、不同測序中心、或者僅使用經過基因組比對過濾的 Kraken 數據，診斷微生物特徵都在（圖8）。

作者用 SHOGUN 流程進一步驗證，SHOGUN 是一個基於比對算法，簡化的，基於系統發育和只有細菌的數據庫的微生物分類流程。驗證使用的數據是基於 Kraken 的分析的，包括 13,517 TCGA 樣本（癌症類型（n = 32），樣品類型（n = 7），測序平臺（n = 6）和測序中心（n = 8））。儘管使用了較小的，不相同的基礎數據庫，SHOGUN 數據處理依舊有批次效應。數據歸一化處理和 ML 模型訓練預測後，發現數據集之間的區分性能沒有重大差異（圖9）。總而言之，結果表明微生物群落對於每種癌症類型都是唯一的，而且僅基於微生物區分癌症的歸一化和模型訓練方法可以得到廣泛的應用。

圖6. f–h, Heatmaps of classifier performance metrics (AUROC (ROC) and AUPR (PR)) from red (high) to blue (low) for distinguishing between TCGA primary tumours (f), between tumour and normal samples (g), and between stage I and stage IV cancers (h). NA, fewer than 20 samples available in any ML class for model training.

圖7. g, h, Linear regressions of model performance, specifically AUROC (g) and AUPR (h), for discriminating between types of cancer in a one-cancer-type-versus-all-others manner, as a function of minority class size.

圖8. Internal validation of ML model pipeline

圖9. Orthogonal validation of Kraken-derived TCGA cancer microbiome profiles and their ML performances

03.微生物譜的生物學相關性

鑑於微生物特徵具有區分效果，作者用生態學預期和/或臨床檢驗尋求其生物學相關性的證據。為了評估與癌症相關的微生物是否是生態學預期的（即“原生”器官特異性共生群落的一部分），將 HMP2 項目中覆蓋 8 個身體部位的 217 個樣本（數據處理同上述）作為訓練集用貝葉斯微生物源追蹤算法以評估 70 個 COAD 實體瘤癌旁樣本和 122 個 SKCM 原發性腫瘤各身體部位的佔比。糞便是主要的人體部位貢獻者，但僅對 COAD 有貢獻，而 SKCM 並不是。這表明該部位的微生物生態的一部分是特有的（圖10）。

梭桿菌屬（Fusobacterium spp.）已報道與胃腸道腫瘤的發生和發展有關，梭桿菌屬在原發性腫瘤高丰度，相對於實體瘤癌旁組織，尤其和血液正常樣品。泛癌分析也顯示在原發性腫瘤組織和實體瘤癌旁組織中，梭桿菌丰度在胃腸（GI）癌症(n = 8)比對非胃腸道腫瘤(n = 24)的丰度高。也發現在原發性腫瘤組織和實體瘤癌旁組織的幽門螺桿菌無差異（圖11）。

隨後，確證帶有臨床註釋的 TCGA 病毒感染，使用兩種不同的生物信息流程檢測 TCGA 的病毒：（i）從頭基因組組裝方法和（ii）基於 read 的方法（PathSeq 算法）。

在 CESC 和 HNSC 的原發性腫瘤中臨床診斷 HPV 感染“陽性”、“陰性”兩組之間，Alphapapillomavirus 屬丰度顯著差異，CESC 的血液正常樣本作為陰性對照，在統計學上無差異。Alphapapillomavirus 是有選擇性地過度表達，相比較其他腫瘤和樣本類型（圖12）。

在原發性腫瘤和實體瘤癌旁組織中，HBV genus (Orthohepadnavirus) 在有乙型肝炎病史的肝細胞癌（LIHC）患者選擇性過表達，相比較丙型肝炎病史的 LIHC 患者。LIHC 的血液正常樣本作為陰性對照，在統計學上無差異（圖13）。

同樣，通過比較 STAD 分子亞型患者的原發性腫瘤、實體瘤癌旁組織、血液正常樣本的 EBV (Lymphocryptovirus) 丰度，EBV 也只選擇性地 EBV 感染的 STAD 的原發性腫瘤過表達，實體瘤癌旁組織、血液正常樣本的均無顯著差異（圖13）。

這些數據與癌症之間預測模型得到結論一致，即具有已知微生物“驅動力”或“共生菌”的癌症提供了該模型與生態學相關的初步證據。例如，乳頭瘤病毒屬是鑑定 CESC 腫瘤的最重要特徵；Faecalibacterium 與 COAD 腫瘤；正肝炎病毒屬是 LIHC 腫瘤第二重要的特徵（僅次於 hepatotoxic Microcystis genus）。為了方便更多科學家日後深入研究其中關係，作者將數據部署在交互網站（http://cancermicrobiome.ucsd.edu/CancerMicrobiome_DataBrowser），以便大家擴展研究更多樣本和微生物。

圖10. a, Average body site attribution for solid-tissue normal samples from patients with COAD (n = 70) using Source Tracker232 trained on the HMP2 data set.

圖11. b, Differential abundances of the Fusobacterium genus for common gastrointestinal (GI) cancers associated with Fusobacterium spp.

圖12. d, e, Normalized HPV abundances for HPVinfected patients with CESC (d) or HNSC (e), as clinically denoted in TCGA. ISH, in situ hybridization; IHC, immunohistochemistry. (c), Pan-cancer normalized abundances of Alphapapillomavirus with a one-way ANOVA (Kruskal–Wallis) test for microbial abundances across types of cancer for each sample type.

圖13. f, Normalized Orthohepadnavirus abundance in patients with LIHC with clinically adjudicated risk factors: HepB, prior hepatitis B infection; EtOH, heavy alcohol consumption; HepC, prior hepatitis C infection. g, Normalized EBV abundance in STAD integrative molecular subtypes: CIN, chromosomal instability; GS, genome stable; MSI, microsatellite unstable; EBV, EBV-infected samples.

04.衡量和減少汙染

衡量和減少汙染對更好地描述推定與癌症相關的微生物至關重要。先前報告 TCGA 鑑定汙染物有 6 種：（表皮葡萄球菌，痤瘡丙酸桿菌，青枯菌，分枝桿菌，假單胞菌和不動桿菌）基於跨類型的癌症中常見的低丰度 read。但最近研究表明，外部汙染物與樣品的分析物濃度負相關的頻率更加一致，且能被穩健統計框架被檢測到。

作者分別用 TCGA 樣品處理過程中 DNA 和 RNA 濃度和分類 read 部分鑑定假定的汙染物，還刪除“空白”試劑中發現的屬（n = 94）。還有五種偽汙染物摻入原始數據集中，跟蹤去汙軌跡，監督歸一化和 ML。我們已知測序技術存有誤差，作者收集並刪除任何一個測序中心（n = 8）都被視為汙染物。經過上述處理，得到了假定的汙染物 list，人工文獻複核，重新允許致病菌或者混合證據的屬（即是致病菌又是常見的汙染物，如分枝桿菌）就產生了兩個汙染物 list，一個去除了可能的汙染物，另一個去除了所有假定的汙染物。作者還按照嚴格的要求設置了第三個“最嚴格的過濾”數據集，使用第三個數據集丟棄了約 92％ 的總讀取次數。但去汙染似乎未對所研究的樣品或癌症類型產生差異影響（圖14）。

計算模擬去汙不能替代在癌症樣品上按金標準處理，包括無菌處理，無菌認證的試劑，從始至終處理的陰性試劑空白以及多樣品合併為“陽性”控制。此時計算機的模擬只是反映了當前現有的技術，並非旨在檢測汙染物或交叉汙染。後者汙染不可能在許多測序中心和多年收集的癌症類型之間或內部信號一致的，但也限制生物學結論，如果不加以控制，尤其在小型研究中。

嚴格去汙的另一個風險是可能會丟棄 反映共生的，組織特異性的微生物群落和預測癌症的微生物特徵的真實信號。作者重新計算 COAD 實體瘤癌旁組織（n = 70）的身體來源佔比，發現連續嚴格的去汙處理可以識別先前無法識別的共存組織。作者重新計算了圖 6f-h 中所示的所有 ML 模型，並比較了每種去汙方法前後的性能（圖15）。假定汙染物對大多數模型沒有影響，儘管 DLBC 和 MESO 的模型變得不太可靠。正如預期，嚴格去汙在不同腫瘤類型（如 COAD 與其他所有癌症）效果不佳，但是組織內比較（例如，腫瘤與正常）通常良好或者更好。這結果表明，某些比較可能需要嚴格的過濾，但是採用通用的去汙可能會刪除生物學信號（圖16）。

圖14. The decontamination approach along with its results, benefits, and limitations on cancer microbiome data. a, Various approaches used to evaluate, mitigate, remove and/or simulate sources of contamination. b, The proportion of remaining taxa or microbial reads in TCGA after varying levels of decontamination. Decontamination by sequencing centre removed all taxa identified as a contaminant at any one sequencing centre (n = 8 batches); decontamination by plate–centre combinations removed all taxa identified as a contaminant on any single sequencing plate with more than ten TCGA samples on it (n = 351 batches).

圖15. c–f, Body-site attribution prediction on the likely contaminants removed data set (c), the plate–centre decontaminated data set (d), the all putative contaminants removed data set (e), and the most stringent filtering data set (f). g–l, All of the models and concomitant performance values (AUROC and AUPR) were re-generated using the four decontaminated data sets described above (each labelled with a different colour as shown above). The AUROC and AUPR values obtained from models trained and tested on the decontaminated data sets are plotted against the AUROC or AUPR values from the full data set (Fig. 1f–h).

圖16. Measuring spiked pseudo-contaminant contribution in downstream ML models and theoretical sensitivities of commercially available, host-based, ctDNA assays in patients from TCGA. a, b, Feature importance scores were calculated for all taxa used in models trained to discriminate one cancer type versus all others in all four decontaminated data sets (Extended Data Fig. 6b) using primary tumour microbial DNA or RNA (a), or using blood-derived mbDNA (b).

05.用血液微生物DNA預測

先前文獻已有證據表明基於血液微生物 DNA（mbDNA）在癌症中可成為臨床信息，但尚不清晰適用範圍。所以作者用 TCGA 血樣的 WGS 數據，將 ML 策略應用於完整數據集和四個去汙染數據集，發現論是基於微生物分類算法或者經基因組比對過濾的 Kraken 數據，mbDNA 可以區分多種癌症（圖17a）。回顧性分析表明，很少有模型預測的 marker 含有汙染物，因為這樣的模型（CESC、KIRP、LIHC）不太可靠。

受這些發現的啟發，作者將 ML 模型與現有的液體活檢（ctDNA檢測）比較，關注液體活檢失敗的情況：沒能檢出基因組改變 Ia–IIc 期癌症和腫瘤。剔除來自這些隱匿的 III 期或 IV 期癌症的患者血液正常樣品後，重建新的 ML 模型。發現 mbDNA 能很好區分癌症類型。進一步剔除 Guardant360 和 FoundationOne 液體活檢測到一種或多種靶向修飾的 TCGA 患者，ML 模型對剩餘的大多數類型的癌症依舊錶現良好（圖17）。

這些分析受限於液體活檢用的是血清而不是全血，mbDNA 來源分佈也不得而知。由於無法獲得 RNA 數據，就無法得知這些 mbDNA 是來自活的還是死的微生物。由於 TCGA 的 SOP 中允許用全血或血沉棕黃層提取物，無法確定 mbDNA 是否遊離還是存在宿主白細胞的。如果不檢測主要樣本和匹配腸上皮細胞不可能得知 mbDNA 的起源，如某些癌症意想不到的方式“洩漏” mbDNA（如，白血病腸細菌的易位）。

由於去汙對模型性能的影響因癌症的類型而異，理想去汙可能是連續的過程，但本文中的過濾受到以下限制：（i）無法獲得主要樣本，（ii）屬水平分類學解析度，（iii）不知道同時處理了非 TCGA 樣本。

圖17. Classifier performance for cancer discrimination using mbDNA in blood and as a complementary diagnostic approach for cancer ‘liquid’ biopsies. a, Model performance heatmap analogous to Fig. 1f–h to predict one cancer type versus all others using blood mbDNA with TCGA study IDs on the right; at least 20 samples were required in each ML minority class to be eligible. b, ML model performances predicting one cancer type versus all others using blood mbDNA for stage Ia–IIc cancers. c, d, ML model performances using blood mbDNA from patients without detectable primary tumour genomic alterations, per Guardant360 (c) and FoundationOne Liquid (d) ctDNA assays.

06.驗證血液的微生物特徵

最後，作者用真實樣品的血漿來源，遊離 mbDNA 特徵的區分健康於多種類型癌症以驗證上述的結論，將對標液體活檢。雖然血漿是全血的子集但未曾在 TCGA 中研究，限制了可比性，但是鑑於血漿的穩定性（如可凍結性），生物存儲庫可利用性和生物學解釋方面具有主要優勢，所以選擇了血漿。

驗證對象包括 69 名無癌症和無 HIV 的個體，100 名三種類型癌症的患者：前列腺癌（n = 59；PC）；肺癌（n = 25；LC）和黑色素瘤（n = 16；SKCM）（圖18a）。

由於沒有現有文獻來評估效應量，匹配來自 Broad Institute 和 HMS 測序中心 TCGA癌症血樣進行了獨立模擬，以估算最小樣本量（圖19）。

遊離 DNA 提取引入多個對照（梯度稀釋的Aliivibrio fischeri (genus: Aliivibrio) ，DNA 提取對照，DNA 文庫製備對照，空白對照），且宏基因組深度測序是限於有限用戶處理和單一文庫製備。單一 run。剔除人源 read，Kraken 獲得分類信息，基於 DNA 濃度和陰性對照嚴格去除汙染物。Voom-SNM 轉換歸一化，年齡和性別歸一化後，ML 能很好區別健康對照和癌症患者（圖18c-h）。

由於樣本量較小，作者還對歸一化數據進行了留一法（LOO）迭代 ML，發現健康樣本與癌症類型之間以及它們之間的成對和多類比較都具有很高的區分性（除了樣品較少的 SKCM）（圖.4C-K）。即便從 PC 和 LC中 匹配以 SKCM 相應的隊列規模，再次迭代區分，SKCM 的ML 模型還是表現不佳，並且前面的數據集結果中 SKCM 表現也是倒數第二，說明了 SKCM 性能普遍存在缺陷，有待改進（圖18i-k）。

為了確保 Kraken 數據的有效性，再次執行 SHOGUN 流程，也能得到高度一致的性能。

圖18. Performance of ML models to discriminate between types of cancer and healthy controls using plasma-derived, cell-free mbDNA. a, Demographics of samples analysed in the validation study. All patients had high-grade (stage III–IV) cancers of multiple subtypes and were aggregated into PC, LC, and SKCM groups. b, Bootstrapped performance estimates for distinguishing grouped cancer samples (n = 100) from non-cancer healthy controls (n = 69). Rasterized density plot of ROC (top) and PR (bottom) curve data from 500 iterations with different training–testing splits (70%–30%). c–h, LOO iterative ML performances between two classes: PC versus control (Ctrl; c), LC versus control (d), SKCM versus control (e), PC versus LC (f), LC versus SKCM (g), and PC versus SKCM (h). i–k, Multi-class (n = 3 or 4), LOO iterative ML performances to distinguish among types of cancer (i) and between mixed patients with cancer and healthy control individuals ( j, k). Overall LOO ML performance was calculated as the mean of performances when comparing one versus all others (shown below as confusion matrices).

圖19. a, Discriminatory simulations in TCGA used to empirically power the real-world validation study (Fig. 4; see Methods). Centre values for each stratified sample size are the means of the performances across ten iterations; error bars denote s.e.m.

結果與討論

各類癌症與特定微生物群之間存在廣泛的關聯，這些微生物特徵似乎能區分大多數類型的癌症，包括商業的液體活檢無法檢測出基因組改變的癌症早期患者。

即便經過大量內部驗證檢查和去汙染，甚至丟棄超過 90％ 的總數據，結論依舊有效。

僅用血漿中游離的 mbDNA 同時設置大量內部和外部的汙染對照，對健康對照組和患有多種類型癌症患者同樣具有較高的區分度，提示使用廣泛可用的樣本進行臨床相關和回顧性檢驗是可行且可推廣的。

追蹤核酸是否來自腫瘤微環境和血液中的活微生物，宿主細胞或裂解細菌需要更多研究工作來確定。

腫瘤中低生物量微生物測定仍受到現有技術的限制。

M菌筆記

數據網頁：

http://cancermicrobiome.ucsd.edu/CancerMicrobiome_DataBrowser

參考文獻

Poore G D, Kopylova E, Zhu Q, et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach[J]. Nature, 2020: 1-8.

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