作為mRNA疫苗mRNA vaccine概念的提出可以追溯到1989年。一般的疫苗是通過病原體本身或其中的一部分或免疫分子，注射機體，引起免疫反應來保護機體。而mRNA疫苗是將mRNA傳遞至細胞，表達產生蛋白，進而擴大機體的免疫能力。mRNA作為疫苗分子相對於DNA作為疫苗分子有如下一些優點：它不需要任何的核定位信號、轉錄及不可能整合到基因組，這避免了任何可能的治療性突變。mRNA的使用也會帶來一些問題，比如mRNA在生理條件下的不穩定性及引發不必要的免疫反應。單鏈或雙鏈的RNA分子與模式識別受體相互作用，包括Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）及視黃酸誘導基因蛋白I（retinoic acid inducible gene protein I，RIG-I），隨之通過髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、β干擾素啟動子刺激蛋白1（interferon-β promoter stimulator 1，IPS-I）等下游的信號通路蛋白來進一步激活免疫反應。mRNA自身的不穩定性及體內外廣泛存在的RNA酶，mRNA疫苗的研究長期以來一直沒有實質性的突破。近年來，由於mRNA合成技術、分子修飾技術及傳遞技術的發展，mRNA疫苗正逐步走向成熟，在腫瘤、感染性疾病等的防治上有著廣泛的應用前景。
1、 mRNA疫苗的分子設計與化學修飾
真核生物的mRNA一般由如下元件組成：5’帽子結構、5’非翻譯區（untranslated region，UTR）、開放閱讀框（open reading frame，ORF）、3’非翻譯區和1個大約100~250 bp 的多聚腺苷酸尾巴Poly（A）。mRNA疫苗的合成一般以含有靶蛋白開放閱讀框的質粒DNA或其他DNA片段作為模板，通過體外轉錄技術合成而構成。由於mRNA在5’端含有帽子結構，3’端含有Poly（A）的結構，在體外轉錄合成mRNA後，一般需要加上這些元件。Rawai等發現使用抗反向帽子類似物（anti-reverse cap analogue，ARCA）能夠避免帽子結構整合到mRNA的錯誤位置。使用其它帽子結構如加帽酶（capping enzyme,CE）及2-氧-甲基轉移酶獲得的帽子0（cap 0）及帽子1（cap 1）也顯著的增強了mRNA的穩定性。另外，由於mRNA的高度不穩定性，研究者也往往通過增加一些其他不編碼蛋白的區域及其他複合物來增加它的穩定性，如Zhao 等[9] 使用了2 個β珠蛋白（β-globin）非翻譯區，大大地增強mRNA 的穩定性。最近報道了CureVac公司在不改變mRNA編碼蛋白質序列的前提下改變了mRNA的其他序列，消除了部分核酸酶的酶切位點，使mRNA的穩定性提高了1萬倍。近年來，使用化學修飾的方法體外合成mRNA以提高其穩定性和降低其免疫原性的報道開始出現。Karikó等[11]報道了使用不同的化學修飾核苷酸體外合成mRNA，發現使用100%假尿苷化學修飾的mRNA注射小鼠能顯著地增強mRNA的轉譯效率及降低其免疫原性。Kormann等[12]報道了使用25%的5-甲基胞苷、25%的2-硫尿苷、化學修飾體外合成的mRNA，傳遞到人外周血單核細胞內，能顯著地降低mRNA 結合到模式識別受體如TLR3、TLR7、TLR8及RIG-I 的機率，且表現出更低的免疫原性及更高的穩定性。Mays等使用10%的5-甲基胞苷、10%的2-硫尿苷，化學修飾體外合成的轉錄因子Foxp3 mRNA，傳遞到A549 細胞，能顯著提高mRNA 的穩定性，表達的靶蛋白量也隨之增大。Warren等使用了100%的5-甲基胞苷及假尿苷來化學修飾mRNA，然後將化學修飾的mRNA傳遞至不同的細胞。Uchida等使用了20%的5-甲基胞苷，10%的2-硫尿苷及10%的假尿苷來化學修飾mRNA注射小鼠。
2 、mRNA疫苗的傳遞
早期文獻報道了陽離子脂質體、DEAE-右旋糖苷、多聚賴氨酸、樹突狀聚合物等各種物質應用於mRNA的傳遞[6]。使用電穿孔技術將mRNA傳遞至人類造血細胞以及胚胎幹細胞可以達到50%~90%的轉染效率。因為mRNA不需進入細胞核，只需使用較弱的電脈衝可以降低對細胞的毒性，另外使用電穿孔技術mRNA無需與模式識別受體結合，大大降低了mRNA傳遞造成的不必要的免疫反應。近年來廣泛報道了使用TransIT-mRNA轉染試劑應用於mRNA的傳遞，此試劑為非脂質體轉染試劑，細胞毒性小，無明顯的促細胞凋亡作用。使用TransIT-mRNA轉染試劑包裹mRNA，肌肉內注射小鼠也顯著提高了蛋白的表達。一些正鏈RNA病毒，甲病毒屬（如辛德華斯病毒、福斯特病毒）、小核糖核酸病毒、黃病毒、仙台病毒等可用於mRNA的傳遞，這些病毒攜帶有靶蛋白的基因，它們的主要優點是隻需進入細胞質，就可表達出所需要的蛋白。仙台病毒有一些突出的優點，它們沒有基因毒性同時能感染各種類型的哺乳動物細胞或組織，而且也能被細胞膜內的神經氨酸所吸附而勿需通過內吞作用進入細胞，這樣就避免了TLR信號的識別。但是，目前發現這些病毒載體可以導致細胞病變，這大大的限制了它們的使用。Su等[16]使用聚β氨基脂納米顆粒（nanoparticles with a poly β-amino ester，PBAE）包裹磷脂雙層用於mRNA傳遞樹突狀細胞，獲得了較低的細胞毒性和相對較高的轉染效率，這一方法其它的優點是對pH值敏感的PBAE 可以促進內含體的破壞。最近，Uchida等報道了使用聚乙二醇（PEG）-多聚氨基酸共聚物納米膠束，來攜帶mRNA進入中樞神經系統。這種50 nm直徑納米膠束擁有包含mRNA的內核被PEG 包裹，提供了其高度的穩定性和傳遞mRNA的能力。使用這種方法能獲得蛋白表達，也大大地降低了mRNA 的免疫原性。新的用於mRNA傳遞系統的包括金納米顆粒偶聯於DNA寡聚核苷酸（AuNP-DNA）。Brito 等使用MF59 陽離子乳液（cationic nanoemulsion, CNE）傳遞mRNA，檢測到肌肉細胞內蛋白的表達效果類似於病毒載體。Walch Rückheim等[19]使用重組的非洲裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）傳遞DNA或mRNA至小鼠巨噬細胞及人類樹突狀細胞，誘導了靶蛋白的表達。
3、 mRNA疫苗用於腫瘤的防治研究
mRNA疫苗應用於抗腫瘤一般有2種策略，一是將mRNA傳遞至抗原提呈細胞即樹突狀細胞；一是直接傳遞mRNA至體內。Zhou等使用人工合成的人類黑色素瘤相關抗原gp100的mRNA與日本仙台病毒（Hemagglutinating virus of Japan，HVJ）脂質體包裹，然後直接注射至小鼠脾臟，誘導出了靶向gp100 的抗體及細胞毒性T 淋巴細胞的活性。Sebastian等[22]使用一種針對6種廣泛表達於非小細胞性肺癌腫瘤抗原NY-ESO-1、MAGEC1、MAGEC2、5 T4、survivin 以及MUC1CV9202 的mRNA 疫苗，誘導出了顯著的抗腫瘤免疫反應。Van Lint等將腫瘤抗原mRNA 與Trimix（CD40 及CD70 的mRNA 混合物）一起通過電穿孔技術傳遞小鼠樹突狀細胞，能夠更為有效地誘導樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的成熟。Fotin Mleczek等[24]使用雙組分mRNA疫苗，一種是抗原mRNA如前列腺腫瘤特異性抗原，另一種為增強免疫刺激的TLR7配基蛋白的mRNA，免疫小鼠後，獲得了持續的抗腫瘤免疫活性。雙組分的mRNA疫苗具有輔助活性誘導持續的抗腫瘤活性，而且這種直接注射而引起的免疫應答反應迅速而劇烈，能夠取得較好的療效，為腫瘤患者的治療爭取更多的時間。Li等使用重組噬菌體MS2病毒類似顆粒（VLPs）包裹mRNA，在被巨噬細胞吞噬後12 h可檢測到靶蛋白的表達，並隨之誘導出抗前列腺腫瘤免疫活性，成功地延滯了腫瘤細胞的成長。迄今，mRNA疫苗已廣泛應用於前列腺癌、急性骨髓白血病、轉移黑色素瘤、成神經細胞瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、腦癌等多種類型腫瘤的治療研究。
4 、mRNA疫苗用於感染性疾病的防治研究
流感病毒表面有2種抗原血凝素（HA）和神經氨酸酶(NA)組成，Petsch等[8]最近報道將人工合成一段流感病毒H1N1血凝素蛋白的mRNA注入到小鼠皮膚裡，在細胞內翻譯出病毒蛋白後，進而誘導免疫反應保護小鼠免受流感病毒的感染。Pollard等使用陽離子脂質DOTAP/DOPE包裹Ⅰ型人類免疫缺陷病毒抗原Gag的mRNA，皮下免疫小鼠，誘導出了Ⅰ型干擾素的分泌，及抗原特異性的、功能性的T細胞反應。Zou 等使用人類天然免疫分子CAMP、S100A8/A9這2類天然免疫分子的mRNA來擴大口腔上皮細胞抵抗侵染性細菌的能力，發現抗菌肽CAMP（cathelicidin antimicrobial protein，CAMP）或鈣衛蛋白S100A8/A9 mRNA轉染後，均能獨立地增強口腔上皮細胞抵抗李斯特菌或沙門氏菌侵染的能力。該工作的獨特性在於傳遞天然免疫分子的mRNA而不是通過傳遞病原菌蛋白mRNA來誘導特異性的免疫反應。
5 、mRNA疫苗用於其它疾病的防治研究
Weiss等[27]使用mRNA疫苗在小鼠模型上針對Ⅰ型過敏反應的預防，能夠有效阻止IgE引起的過敏性表型誘導，如過敏反應相關細胞因子的產生、嗜酸性粒細胞肺浸潤、呼吸道高反應性等。Mays等]發現使用化學修飾的轉錄因子叉頭狀家族蛋白3（Forkhead/winged-helix protein 3, FOXP3）mRNA 傳遞鼠肺用於防止哮喘，發現化學修飾的FOXP3mRNA傳遞可以重新平衡肺部T輔助細胞反應、過敏原引起的組織炎症及其他過於強烈的呼吸道反應。機制上，FOXP3的誘導通過IL-10依賴的信號通路調節天然免疫細胞的募集進而影響Th2及Th17型炎症反應。
綜上所述，mRNA疫苗技術發展非常迅速，且仍有寬廣的發展空間。新的mRNA 疫苗的設計、mRNA傳遞技術的發展均可以影響到靶蛋白的表達及mRNA與模式識別受體的相互作用。直接將mRNA傳遞至細胞質可以增強靶蛋白的表達，避免與模式識別受體的結合也可大大減弱mRNA傳遞本身帶來的免疫刺激。新的方法來增強mRNA靶向特異性的細胞類型也成為mRNA疫苗潛在的突破方向[29]。在mRNA 傳遞過程中包含一些附屬的mRNA分子也可能成為獲得更好免疫效果的突破方向。但是，這些可能的突破方向都會增加mRNA疫苗生產及處理方法的複雜性。而傳統的免疫佐劑均能抑制mRNA疫苗蛋白的表達。從mRNA的本身特性、引發的免疫反應情況、大規模疫苗生產的有利條件等方面來看，mRNA疫苗具有其它疫苗無法比擬的優勢。迄今，mRNA用於治療的目的，還限制在癌症的免疫治療中通過將mRNA轉入樹突狀細胞方面。目前mRNA疫苗的研究主要聚焦於增強mRNA的穩定性、降低其免疫原性和發展新的傳遞技術，而將mRNA疫苗應用於不同類型疾病的防治研究也在不斷的拓展。可以預計，新的高效、穩定的mRNA傳遞技術將成為mRNA疫苗應用於臨床的關鍵。總之，mRNA疫苗的研究將在腫瘤及感染性疾病等的防治領域發展迅猛。
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