柴继杰教授，博导，长江学者特聘教授，国家杰出青年基金获得者
造纸工人和清华教授，这似乎是两个没有交集的职业。但在柴继杰教授身上，这两者有了交集。1983年，柴继杰教授从大学毕业后，进入丹东鸭绿江造纸厂工作，成为一名造纸工人。如果他甘愿平凡，那么他很有可能在这里工作一辈子直至退休。但柴继杰并不是一个“安分守己”的人。1999年，他来到普林斯顿大学跟随施一公教授做博士后。但施一公教授却嫌他基础太差，认为他差不多算是白纸，而且柴继杰还比自己大一岁。但经过慎重考虑后，施一公认为柴继杰教授大有作为，于是收下这位学生，也成为柴继杰的伯乐。柴继杰教授的经历带给我们太多思考。从造纸工人到长江学者，这需要何等的毅力和勇气！
此外，根据我们公众号iPlants统计，植物抗病领域现有的几乎所有的复合体结构都出自柴继杰教授实验室，其中最具挑战和突破的是今年4月份发表的抗病小体结构，具体如下：
1. 抗性蛋白-蛋白激酶Pto与丁香假单胞杆菌中的效应蛋白AvrPto的复合物
2007年8月12日，柴继杰实验室在《Nature》杂志上在线发表题为 “The structural basis for activation of plant immunity by bacterial effector protein AvrPto” 的文章。该文章报道了第一个细菌效应蛋白和植物中对应的抗性蛋白的复合物AvrPto-Pto的晶体结构，基于该结构和相关实验结果，提出了AvrPto通过解除Pto对防御响应的抑制引发疾病抗性的机制。
植物的抗性蛋白精确识别病原菌中的效应蛋白,对引发植物防御响应非常重要。利用蛋白质晶体学、生物化学和遗传学的方法，研究了番茄中的抗性蛋白-蛋白激酶Pto与丁香假单胞杆菌中的效应蛋白AvrPto的复合物，从分子水平上揭示了细菌效应蛋白AvrPto激活植物免疫系统的结构基础。该研究对深入探讨植物如何识别病原菌的效应蛋白启动防御反应、限制病原菌繁殖的复杂抗病机制有重要的意义。
该研究运用克隆、表达和纯化技术制备了AvrPto-Pto复合物，并首次生长出合适的晶体，然后用MAD方法测定了其晶体结构。该复合物的晶体结构揭示了AvrPto 与Pto 相互作用通过两个界面调节。遗传学与生物化学实验表明AvrPto通过解除Pto 对防御的抑制作用而引起抗病反应。生化实验研究结果显示AvrPto的活性loop 的磷酸化对Pto识别AvrPto 具有非常重要的调节作用。结构比对表明AvrPto 作为Pto 的假底物与Pto 结合，AvrPto可能是Pto 激酶的抑制剂。生化实验进一步证明：在体外，AvrPto 的确可以抑制Pto 的激酶活性，提示AvrPto 在易感的植物内通过抑制蛋白激酶的活性发挥其毒性功能，而Pto 可能进化来模拟AvrPto 的毒性目标从而阻断其毒性功能。
2. 几丁质--植物先天免疫受体蛋白AtCERK1的结构
2012年6月1日，清华大学生命学院柴继杰教授研究组、中科院遗传与发育研究所周俭民研究组和郑州大学常俊标研究组合作在Science在线发表了题为“Chitin-Induced Dimerization Activates a Plant Immune Receptor”（几丁质诱导的二聚化激活了一个植物免疫受体）的文章，阐明了植物先天免疫受体蛋白AtCERK1识别配体的分子机制和参与信号转导的生化机理。
植物的先天免疫是植物免疫系统的重要组成部分。在植物的细胞膜上存在多种模式识别受体，通过识别病原体上的一些共有的、保守的分子基序（也即病原相关分子模式），引发先天免疫反应。真菌病原体细胞壁的主要组分几丁质是β-1,4连接的N –乙酰氨基葡萄糖的多聚物，可以作为一种病原分子相关模式刺激植物产生免疫反应。几丁质在拟南芥中的受体AtCERK1是一种LysM类型的受体样激酶，胞外含有三个串联的LysM结构域。已有的研究结果表明，体外表达纯化的AtCERK1能直接结合几丁质，但是其识别几丁质的分子机制和结合几丁质后的激活机制却亟待阐明。
柴继杰研究组通过解析AtCERK1的胞外区与几丁质五糖的复合物结构，阐明了AtCERK1通过识别几丁质上的N –乙酰基团，从而特异性识别几丁质的分子机制。根据结构数据的提示，柴继杰研究组与周俭民研究组合作，通过多种体外生化和植物体内实验，发现并证明了几丁质激活AtCERK1的机理。研究结果表明：当植物宿主细胞感受到几丁质时，植物细胞膜上的AtCERK1通过胞外LysM结构域二聚化来完成配体感应并激活下游防卫反应信号通路。通过竞争实验发现几丁质诱导的AtCERK1的二聚化对信号传导是必需的。
AtCERK1的结构是第一个被解析的植物模式识别受体结构，为其它具有类似结构的受体研究提供了借鉴。更为重要的是，该项研究发现了AtCERK1的激活机理，这为理解植物免疫调控及其它受体激酶的作用方式提供了一个宝贵的模型。
3. 植物模式识别受体FLS2及共受体BAK1与flg22三元复合物结构
2013年10月10日，清华大学生命科学学院柴继杰教授研究组、中科院遗传与发育研究 所周俭民研究员研究组和英国诺维奇科技园圣斯伯利实验室（Sainsbury Lab，Norwich Research Park）的Cyril Zipfel教授研究组合作在《科学》（Science）在线发表题为Structural basis for flg22-induced activation of the Arabidopsis FLS2-BAK1 immune complex的研究论文，首次报道了植物模式识别受体FLS2及共受体BAK1与细菌模式分子鞭毛蛋白保守基序flg22三元复合物晶体结构，并通过结构分析和体内外生化实验揭示了该复合物活化的分子机制。
先天免疫是动植物免疫系统的重要组成部分。在植物的细胞膜上存在多种模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)，通过识别病原体上的一些共有的、保守的分子基序（也即病原相关分子模式pathogen-associated molecular patterns,PMAP），引发先天免疫反应。对细菌运动性极其重要的一种蛋白flagellin既是一种典型的PMAP。FLS2 是存在于大多数高等植物中，对于抗菌免疫至关重要的一种LRR类型的受体激酶。作为一种典型的PRR，它能够直接识别对细菌运动性极其重要的一种蛋白 flagellin的高度保守 N 末端表位（Flg22），同时遗传及生化实验表明其激活需要另一种LRR受体激酶BAK1的参与，但是其识别鞭毛蛋白的分子机制和激活机制却亟待阐明。
柴继杰研究组通过解析FLS2胞外区和BAK1胞外区与植物致病菌丁香假单胞菌鞭毛蛋白保守基序flg22复合物结构，阐明了FLS2胞外区通过其 螺线状凹面的连续B片层来识别flg22；结构也提示共受体BAK1仅仅通过N端帽子接触flg22表位的C末端，并且共受体BAK1与FLS2形成广泛 的直接相互作用，提示其可能先形成预复合物，以利于对病原菌的侵入做出快速反应。通过与周俭民研究员研究组和Cyril Zipfel教授研究组合作，从体外生化和植物体内实验也验证了flg22激活FLS2的机理：当植物宿主细胞感受到细菌鞭毛蛋白时，细菌鞭毛蛋白通过诱 导植物细胞膜上的FLS2和BAK1形成异源二聚化来完成配体感应并激活下游防卫反应信号通路。复合物结构也使我们对可以作为许多植物受体共受体的 SERK家族功能有了更深的了解。
FLS2LRR-flg22-BAK1LRR是第一个被解析的植物LRR模式识别受体复合物结构。在模式生物拟南芥中有至少含有200多个富含亮氨 酸重复的受体激酶（在水稻中大约有600多个），这类LRR-RLKS参与了多种多样的生物过程：调控分生组织的生长、抗病性、激素信号传递和组织发育 等。我们的结果也为这一类蛋白结构及功能研究提供了很好的范例。同时这项研究对于开发广谱抗病作物品种具有重要的意义。
4. 植物肽类激素的激活复合物PSK-PSKRLRR-SERKLRR结构
2015年8月26日，清华大学生命科学学院柴继杰教授研究组、中科院遗传与发育研究所 杨维才研究员研究组合作在《Nature》在线发表Allosteric receptor activation by the plant peptide hormone phytosulfokine研究论文，揭示了植物重要肽类激素phytosulfokine (PSK) 的识别和受体激活分子机理。
植物肽类激素，同植物经典激素一样，对植物体的生长发育等生理活动具有重要的调控作用。PSK是较早被发现和研究的一种含两个酪氨酸磺化修饰的五肽 激素，在植物的生长发育、抗逆和先天免疫等方面有广泛调控作用。PSK发挥活性是通过与细胞膜上的受体激酶PSKR结合来发挥功能。但PSK被受体 PSKR识别的分子机理以及后续的受体激活机制还需要阐明。
柴继杰研究组通过解析PSKR胞外区结合PSK的复合物结构，阐明了PSKR胞外区通过其岛区来识别PSK的分子机理。深入的结构分析提示SERK 家族成员可能作为共受体参与PSKR的受体激活，体外生化实验初步证实了这一假设，同时通过与中科院遗传与发育研究所杨维才研究员研究组合作，利用植物体 内生化和遗传学的方法最终证明了这一假设。这也是通过结构生物学提示找到PSK信号转导通路上的新成份。通过解析和对比分析PSKR-PSK-SERK三 元复合物结构和单独的PSKR结构，揭示了PSK通过诱导原本无序的受体PSKR岛区产生与共受体SERK结合的新界面从而别构激活受体PSKR的新机 制。
PSK-PSKRLRR-SERKLRR激活复合物是第一个植物肽类激素的激活复合物结构，为其他植物肽类激素的研究提供了思路，进一步推广了植物受体激酶异元二聚化的活化模式和SERK家族的信号枢纽功能。从结构角度首次揭示配体通过别构诱导受体构象 变化来介导受体与共受体互作的活化模式，区别于BRI1和FLS2通过配体的“胶联”作用结合共受体的这一类似于植物经典激素受体活化的“分子胶”模式。基于PSK受体结构的PSK类似物的研发可用于提高作物产量的生长添加剂，具有重要的实际应用意义。
图为：（A）PSK-PSKR识别复合物结构；（B）PSKR-SERK在植物体水平的互作；（C）PSK-PSKR-SERK激活复合物结构；（D）单独的PSKR和结合PSK的PSKR结构比较。
5. ZAR1-RKS1-PBL2UMP复合物(抗病小体)结构
2019年4月4日，清华大学柴继杰课题组、中科院遗传发育所周俭民课题组和清华大学王宏伟课题联合同期背靠背发表两篇重量级Science文章，完成了植物NLR蛋白复合物的组装、结构和功能分析，揭示了NLR作用的关键分子机制，是植物免疫研究的里程碑事件。两篇文章分别是：
"Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex”的研究论文。该研究通过重建了拟南芥中NLB蛋白ZAR1-RKS1和ZAR1-RKS1-PBL2UMP复合物，并分别以3.7和4.3Å的分辨率确定了它们冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，揭示了ZAR1-RKS1识别PBL2UMP和PBL2UMP激活ZAR1的机制，为理解NLR蛋白提供了结构模板！
"Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity”的研究论文。该研究重建了ZAR1-RKS1-PBL2UMP-dATP活性复合体，证明了其复合体在免疫激活过程中进行寡聚化，并揭示了其激活免疫反应的机制！这两项研究在植物免疫研究领域取得历史性的重大突破，填补了人们25年来对植物抗病蛋白认知的巨大空白，将为研究其它抗病蛋白提供范本。
在第一项研究中，研究者在共同表达了ZAR1与RKS1，并解析了其复合体在ADP结合状态下的冷冻电镜结构。这一代表ZAR1处于“静息状态”的结构表明，RKS1的异二聚体只与ZAR1的富亮氨酸重复（LRR）结构域进行结合，而对这种结合起到关键作用的氨基酸在同一家族中趋于保守。
随后，研究人员们在这个复合体中引入了单尿苷酰修饰（mono-uridylylated）的PBL2，并发现它与RKS1的结合会造成构象的显著变化，将ADP排出ATP结合位点。在没有ATP存在的情况下，这一复合体能处于激活的过渡状态。因此，该研究揭示了ZAR1-RKS1识别PBL2UMP和PBL2UMP激活ZAR1的机制。
在第二项研究中，研究者又往ZAR1-RKS1-PBL2（有单尿苷酰修饰）的复合体中添加了dATP，并获取了冷冻电镜结构。有趣的是，
在dATP的作用下，这一复合体会进一步形成五聚体。研究人员们发现，这种五聚体的氨基端会微微翘起，形成一个漏斗状的结构。他们猜测，这一结构可能会在细胞膜上制造孔洞，协助ZAR1行使其功能。当然，这一猜想还有待进一步的证实。因此，该研究证明了植物中的NLR在免疫激活过程中类似动物中的NLR进行多聚化。
综上所述，这两项研究成功地组装了ZAR1-RKS1-PBL2UMP复合物(抗病小体)，阐明了抗病蛋白从静息状态经过中间状态最终形成抗病小体的生化过程，揭示了抗病小体的工作机制。抗病小体具有重新调动防御系统的能力，并在植物细胞膜上发出自杀指令，让受到感染的植物细胞与细菌同归于尽，从而保护其它健康细胞。该项工作填补了人们25年来对抗病蛋白认知的空白，为研究其它抗病蛋白提供了范本。研究还发现，植物抗病小体的组装方式、结构与功能，与动物免疫中的炎症小体有着惊人的相似，展现了在不同生命形式中，进化对免疫形成的力量。
6. 植物肽类激素-受体--膜锚定蛋白FER-RALF23-LLG2的结构
2019年7月10日，清华大学生命学院柴继杰课题组与英国The Sainsbury Laboratory的Cyril Zipfel课题组合作在国际顶级期刊《自然》（Nature）发表题为“异型受体复合物识别RALF多肽的分子机制”（Mechanisms of RALF peptide perception by a heterotypic receptor complex）的研究论文。该研究通过解析2.77A RALF23-LLG2-FER复合物晶体结构并结合体内功能与体外生化实验，阐明了植物RALF多肽被CrRLK1L型受体激酶与膜锚定GPI蛋白异型识别的分子机制，这种新颖的识别模式为相关蛋白家族的功能研究提供了全新范式。
拟南芥受体激酶Feronia (FER) 是另外一类植物受体激酶CrRLK1L亚家族的成员。CrRLK1L亚家族的成员胞外具有两个特征性的与配体识别相关的串联Malectin结构域。动物Malectin是定位于内质网膜上的蛋白，可特异性识别糖类分子，与蛋白的糖基化修饰有关。植物Malectin结构域同样被报道可识别细胞壁相关多糖pectin。自FER被发现以来，分别有三篇Science文章报道了其在生殖(Escobar-Restrepo JM et al, Science 2007)、生长(Haruta M et al, Science 2014)、免疫(Stegmann M et al, Science 2017)三大植物生理过程中的重要作用。快速碱性化因子(Rapid alkalinization factor, RALF)是一类植物重要的肽类激素，其被认为是受体激酶CrRLK1L亚家族的配体。如RALF1/23被FER识别，RALF4/19由ANX1/2, BUPS1/2识别(Ge et al, Science, 2017; Mecchia MA et al, Science, 2017)等。拟南芥Lorelei (LRE)及LLG1/2/3家族是一类胞外膜锚定蛋白，有研究表明其是FER信号通路的重要参与者(Capron et al., Plant Cell, 2008; Li et al., elife, 2015)。
在本项研究中，柴继杰团队使用结构生物学方法解析了apo-FER, apo-ANX1, apo-ANX2, apo-LLG1和RALF23-LLG2-FER复合物五个晶体结构。结合体内功能遗传实验与体外多种生化手段首次展示了植物多肽RALF被受体激酶-膜锚定蛋白这一异型受体复合物识别的分子机制。拟南芥体内约有250个GPI蛋白，大部分研究表明GPI蛋白作为相关膜蛋白的chaperone，起到帮助膜蛋白在细胞膜系统上运输的作用，目前尚未有植物GPI蛋白直接识别配体的报道。而本项究表明，GPI蛋白LLG1/2/3可作为受体在膜上直接识别配体RALF，并在配体RALF的诱导下形成新的作用面以结合受体激酶FER，使FER-LLG这一异型受体复合物共同完成对配体RALF的识别。
图1. FER-RALF23-LLG2的结构模式图
有别于过去研究发现的受体激酶基于同型二聚或多聚来识别配体的传统模式，本项研究揭示的受体激酶与膜锚定蛋白形成异型复合物识别配体的模式，为植物受体激酶以及膜锚定蛋白的结构功能研究提供了全新的范例。本项研究也纠正了植物Malectin也会识别多糖的认识，证明了动植物Malectin结构域在分别进化后，已获得了截然不同的配体识别功能。
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