柴繼傑教授，博導，長江學者特聘教授，國家傑出青年基金獲得者

造紙工人和清華教授，這似乎是兩個沒有交集的職業。但在柴繼傑教授身上，這兩者有了交集。1983年，柴繼傑教授從大學畢業後，進入丹東鴨綠江造紙廠工作，成為一名造紙工人。如果他甘願平凡，那麼他很有可能在這裡工作一輩子直至退休。但柴繼傑並不是一個“安分守己”的人。1999年，他來到普林斯頓大學跟隨施一公教授做博士後。但施一公教授卻嫌他基礎太差，認為他差不多算是白紙，而且柴繼傑還比自己大一歲。但經過慎重考慮後，施一公認為柴繼傑教授大有作為，於是收下這位學生，也成為柴繼傑的伯樂。柴繼傑教授的經歷帶給我們太多思考。從造紙工人到長江學者，這需要何等的毅力和勇氣！

此外，根據我們公眾號iPlants統計，植物抗病領域現有的幾乎所有的複合體結構都出自柴繼傑教授實驗室，其中最具挑戰和突破的是今年4月份發表的抗病小體結構，具體如下：

1. 抗性蛋白-蛋白激酶Pto與丁香假單胞桿菌中的效應蛋白AvrPto的複合物

2007年8月12日，柴繼傑實驗室在《Nature》雜誌上在線發表題為 “The structural basis for activation of plant immunity by bacterial effector protein AvrPto” 的文章。該文章報道了第一個細菌效應蛋白和植物中對應的抗性蛋白的複合物AvrPto-Pto的晶體結構，基於該結構和相關實驗結果，提出了AvrPto通過解除Pto對防禦響應的抑制引發疾病抗性的機制。

植物的抗性蛋白精確識別病原菌中的效應蛋白,對引發植物防禦響應非常重要。利用蛋白質晶體學、生物化學和遺傳學的方法，研究了番茄中的抗性蛋白-蛋白激酶Pto與丁香假單胞桿菌中的效應蛋白AvrPto的複合物，從分子水平上揭示了細菌效應蛋白AvrPto激活植物免疫系統的結構基礎。該研究對深入探討植物如何識別病原菌的效應蛋白啟動防禦反應、限制病原菌繁殖的複雜抗病機制有重要的意義。

該研究運用克隆、表達和純化技術製備了AvrPto-Pto複合物，並首次生長出合適的晶體，然後用MAD方法測定了其晶體結構。該複合物的晶體結構揭示了AvrPto 與Pto 相互作用通過兩個界面調節。遺傳學與生物化學實驗表明AvrPto通過解除Pto 對防禦的抑制作用而引起抗病反應。生化實驗研究結果顯示AvrPto的活性loop 的磷酸化對Pto識別AvrPto 具有非常重要的調節作用。結構比對錶明AvrPto 作為Pto 的假底物與Pto 結合，AvrPto可能是Pto 激酶的抑制劑。生化實驗進一步證明：在體外，AvrPto 的確可以抑制Pto 的激酶活性，提示AvrPto 在易感的植物內通過抑制蛋白激酶的活性發揮其毒性功能，而Pto 可能進化來模擬AvrPto 的毒性目標從而阻斷其毒性功能。

2. 幾丁質--植物先天免疫受體蛋白AtCERK1的結構

2012年6月1日，清華大學生命學院柴繼傑教授研究組、中科院遺傳與發育研究所周儉民研究組和鄭州大學常俊標研究組合作在Science在線發表了題為“Chitin-Induced Dimerization Activates a Plant Immune Receptor”（幾丁質誘導的二聚化激活了一個植物免疫受體）的文章，闡明瞭植物先天免疫受體蛋白AtCERK1識別配體的分子機制和參與信號轉導的生化機理。

植物的先天免疫是植物免疫系統的重要組成部分。在植物的細胞膜上存在多種模式識別受體，通過識別病原體上的一些共有的、保守的分子基序（也即病原相關分子模式），引發先天免疫反應。真菌病原體細胞壁的主要組分幾丁質是β-1,4連接的N –乙酰氨基葡萄糖的多聚物，可以作為一種病原分子相關模式刺激植物產生免疫反應。幾丁質在擬南芥中的受體AtCERK1是一種LysM類型的受體樣激酶，胞外含有三個串聯的LysM結構域。已有的研究結果表明，體外表達純化的AtCERK1能直接結合幾丁質，但是其識別幾丁質的分子機制和結合幾丁質後的激活機制卻亟待闡明。
　　柴繼傑研究組通過解析AtCERK1的胞外區與幾丁質五糖的複合物結構，闡明瞭AtCERK1通過識別幾丁質上的N –乙酰基團，從而特異性識別幾丁質的分子機制。根據結構數據的提示，柴繼傑研究組與周儉民研究組合作，通過多種體外生化和植物體內實驗，發現並證明了幾丁質激活AtCERK1的機理。研究結果表明：當植物宿主細胞感受到幾丁質時，植物細胞膜上的AtCERK1通過胞外LysM結構域二聚化來完成配體感應並激活下游防衛反應信號通路。通過競爭實驗發現幾丁質誘導的AtCERK1的二聚化對信號傳導是必需的。

3. 植物模式識別受體FLS2及共受體BAK1與flg22三元複合物結構

2013年10月10日，清華大學生命科學學院柴繼傑教授研究組、中科院遺傳與發育研究 所周儉民研究員研究組和英國諾維奇科技園聖斯伯利實驗室（Sainsbury Lab，Norwich Research Park）的Cyril Zipfel教授研究組合作在《科學》（Science）在線發表題為Structural basis for flg22-induced activation of the Arabidopsis FLS2-BAK1 immune complex的研究論文，首次報道了植物模式識別受體FLS2及共受體BAK1與細菌模式分子鞭毛蛋白保守基序flg22三元複合物晶體結構，並通過結構分析和體內外生化實驗揭示了該複合物活化的分子機制。

　　先天免疫是動植物免疫系統的重要組成部分。在植物的細胞膜上存在多種模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)，通過識別病原體上的一些共有的、保守的分子基序（也即病原相關分子模式pathogen-associated molecular patterns,PMAP），引發先天免疫反應。對細菌運動性極其重要的一種蛋白flagellin既是一種典型的PMAP。FLS2 是存在於大多數高等植物中，對於抗菌免疫至關重要的一種LRR類型的受體激酶。作為一種典型的PRR，它能夠直接識別對細菌運動性極其重要的一種蛋白 flagellin的高度保守 N 末端表位（Flg22），同時遺傳及生化實驗表明其激活需要另一種LRR受體激酶BAK1的參與，但是其識別鞭毛蛋白的分子機制和激活機制卻亟待闡明。

　　柴繼傑研究組通過解析FLS2胞外區和BAK1胞外區與植物致病菌丁香假單胞菌鞭毛蛋白保守基序flg22複合物結構，闡明瞭FLS2胞外區通過其 螺線狀凹面的連續B片層來識別flg22；結構也提示共受體BAK1僅僅通過N端帽子接觸flg22表位的C末端，並且共受體BAK1與FLS2形成廣泛 的直接相互作用，提示其可能先形成預複合物，以利於對病原菌的侵入做出快速反應。通過與周儉民研究員研究組和Cyril Zipfel教授研究組合作，從體外生化和植物體內實驗也驗證了flg22激活FLS2的機理：當植物宿主細胞感受到細菌鞭毛蛋白時，細菌鞭毛蛋白通過誘 導植物細胞膜上的FLS2和BAK1形成異源二聚化來完成配體感應並激活下游防衛反應信號通路。複合物結構也使我們對可以作為許多植物受體共受體的 SERK家族功能有了更深的瞭解。

　　FLS2LRR-flg22-BAK1LRR是第一個被解析的植物LRR模式識別受體複合物結構。在模式生物擬南芥中有至少含有200多個富含亮氨 酸重複的受體激酶（在水稻中大約有600多個），這類LRR-RLKS參與了多種多樣的生物過程：調控分生組織的生長、抗病性、激素信號傳遞和組織發育 等。我們的結果也為這一類蛋白結構及功能研究提供了很好的範例。同時這項研究對於開發廣譜抗病作物品種具有重要的意義。

4. 植物肽類激素的激活複合物PSK-PSKRLRR-SERKLRR結構

2015年8月26日，清華大學生命科學學院柴繼傑教授研究組、中科院遺傳與發育研究所 楊維才研究員研究組合作在《Nature》在線發表Allosteric receptor activation by the plant peptide hormone phytosulfokine研究論文，揭示了植物重要肽類激素phytosulfokine (PSK) 的識別和受體激活分子機理。

　　植物肽類激素，同植物經典激素一樣，對植物體的生長髮育等生理活動具有重要的調控作用。PSK是較早被發現和研究的一種含兩個酪氨酸磺化修飾的五肽 激素，在植物的生長髮育、抗逆和先天免疫等方面有廣泛調控作用。PSK發揮活性是通過與細胞膜上的受體激酶PSKR結合來發揮功能。但PSK被受體 PSKR識別的分子機理以及後續的受體激活機制還需要闡明。

　　柴繼傑研究組通過解析PSKR胞外區結合PSK的複合物結構，闡明瞭PSKR胞外區通過其島區來識別PSK的分子機理。深入的結構分析提示SERK 家族成員可能作為共受體參與PSKR的受體激活，體外生化實驗初步證實了這一假設，同時通過與中科院遺傳與發育研究所楊維才研究員研究組合作，利用植物體 內生化和遺傳學的方法最終證明了這一假設。這也是通過結構生物學提示找到PSK信號轉導通路上的新成份。通過解析和對比分析PSKR-PSK-SERK三 元複合物結構和單獨的PSKR結構，揭示了PSK通過誘導原本無序的受體PSKR島區產生與共受體SERK結合的新界面從而別構激活受體PSKR的新機 制。

　　PSK-PSKRLRR-SERKLRR激活複合物是第一個植物肽類激素的激活複合物結構，為其他植物肽類激素的研究提供了思路，進一步推廣了植物受體激酶異元二聚化的活化模式和SERK家族的信號樞紐功能。從結構角度首次揭示配體通過別構誘導受體構象 變化來介導受體與共受體互作的活化模式，區別於BRI1和FLS2通過配體的“膠聯”作用結合共受體的這一類似於植物經典激素受體活化的“分子膠”模式。基於PSK受體結構的PSK類似物的研發可用於提高作物產量的生長添加劑，具有重要的實際應用意義。

圖為：（A）PSK-PSKR識別複合物結構；（B）PSKR-SERK在植物體水平的互作；（C）PSK-PSKR-SERK激活複合物結構；（D）單獨的PSKR和結合PSK的PSKR結構比較。

5. ZAR1-RKS1-PBL2UMP複合物(抗病小體)結構

2019年4月4日，清華大學柴繼傑課題組、中科院遺傳發育所周儉民課題組和清華大學王宏偉課題聯合同期背靠背發表兩篇重量級Science文章，完成了植物NLR蛋白複合物的組裝、結構和功能分析，揭示了NLR作用的關鍵分子機制，是植物免疫研究的里程碑事件。兩篇文章分別是：

"Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex”的研究論文。該研究通過重建了擬南芥中NLB蛋白ZAR1-RKS1和ZAR1-RKS1-PBL2UMP複合物，並分別以3.7和4.3Å的分辨率確定了它們冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，揭示了ZAR1-RKS1識別PBL2UMP和PBL2UMP激活ZAR1的機制，為理解NLR蛋白提供了結構模板！

"Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity”的研究論文。該研究重建了ZAR1-RKS1-PBL2UMP-dATP活性複合體，證明了其複合體在免疫激活過程中進行寡聚化，並揭示了其激活免疫反應的機制！這兩項研究在植物免疫研究領域取得歷史性的重大突破，填補了人們25年來對植物抗病蛋白認知的巨大空白，將為研究其它抗病蛋白提供範本。

在第一項研究中，研究者在共同表達了ZAR1與RKS1，並解析了其複合體在ADP結合狀態下的冷凍電鏡結構。這一代表ZAR1處於“靜息狀態”的結構表明，RKS1的異二聚體只與ZAR1的富亮氨酸重複（LRR）結構域進行結合，而對這種結合起到關鍵作用的氨基酸在同一家族中趨於保守。

隨後，研究人員們在這個複合體中引入了單尿苷酰修飾（mono-uridylylated）的PBL2，並發現它與RKS1的結合會造成構象的顯著變化，將ADP排出ATP結合位點。在沒有ATP存在的情況下，這一複合體能處於激活的過渡狀態。因此，該研究揭示了ZAR1-RKS1識別PBL2UMP和PBL2UMP激活ZAR1的機制。

在第二項研究中，研究者又往ZAR1-RKS1-PBL2（有單尿苷酰修飾）的複合體中添加了dATP，並獲取了冷凍電鏡結構。有趣的是，

綜上所述，這兩項研究成功地組裝了ZAR1-RKS1-PBL2UMP複合物(抗病小體)，闡明瞭抗病蛋白從靜息狀態經過中間狀態最終形成抗病小體的生化過程，揭示了抗病小體的工作機制。抗病小體具有重新調動防禦系統的能力，並在植物細胞膜上發出自殺指令，讓受到感染的植物細胞與細菌同歸於盡，從而保護其它健康細胞。該項工作填補了人們25年來對抗病蛋白認知的空白，為研究其它抗病蛋白提供了範本。研究還發現，植物抗病小體的組裝方式、結構與功能，與動物免疫中的炎症小體有著驚人的相似，展現了在不同生命形式中，進化對免疫形成的力量。

6. 植物肽類激素-受體--膜錨定蛋白FER-RALF23-LLG2的結構

2019年7月10日，清華大學生命學院柴繼傑課題組與英國The Sainsbury Laboratory的Cyril Zipfel課題組合作在國際頂級期刊《自然》（Nature）發表題為“異型受體複合物識別RALF多肽的分子機制”（Mechanisms of RALF peptide perception by a heterotypic receptor complex）的研究論文。該研究通過解析2.77A RALF23-LLG2-FER複合物晶體結構並結合體內功能與體外生化實驗，闡明瞭植物RALF多肽被CrRLK1L型受體激酶與膜錨定GPI蛋白異型識別的分子機制，這種新穎的識別模式為相關蛋白家族的功能研究提供了全新範式。

擬南芥受體激酶Feronia (FER) 是另外一類植物受體激酶CrRLK1L亞家族的成員。CrRLK1L亞家族的成員胞外具有兩個特徵性的與配體識別相關的串聯Malectin結構域。動物Malectin是定位於內質網膜上的蛋白，可特異性識別糖類分子，與蛋白的糖基化修飾有關。植物Malectin結構域同樣被報道可識別細胞壁相關多糖pectin。自FER被發現以來，分別有三篇Science文章報道了其在生殖(Escobar-Restrepo JM et al, Science 2007)、生長(Haruta M et al, Science 2014)、免疫(Stegmann M et al, Science 2017)三大植物生理過程中的重要作用。快速鹼性化因子(Rapid alkalinization factor, RALF)是一類植物重要的肽類激素，其被認為是受體激酶CrRLK1L亞家族的配體。如RALF1/23被FER識別，RALF4/19由ANX1/2, BUPS1/2識別(Ge et al, Science, 2017; Mecchia MA et al, Science, 2017)等。擬南芥Lorelei (LRE)及LLG1/2/3家族是一類胞外膜錨定蛋白，有研究表明其是FER信號通路的重要參與者(Capron et al., Plant Cell, 2008; Li et al., elife, 2015)。

在本項研究中，柴繼傑團隊使用結構生物學方法解析了apo-FER, apo-ANX1, apo-ANX2, apo-LLG1和RALF23-LLG2-FER複合物五個晶體結構。結合體內功能遺傳實驗與體外多種生化手段首次展示了植物多肽RALF被受體激酶-膜錨定蛋白這一異型受體複合物識別的分子機制。擬南芥體內約有250個GPI蛋白，大部分研究表明GPI蛋白作為相關膜蛋白的chaperone，起到幫助膜蛋白在細胞膜系統上運輸的作用，目前尚未有植物GPI蛋白直接識別配體的報道。而本項究表明，GPI蛋白LLG1/2/3可作為受體在膜上直接識別配體RALF，並在配體RALF的誘導下形成新的作用面以結合受體激酶FER，使FER-LLG這一異型受體複合物共同完成對配體RALF的識別。

圖1. FER-RALF23-LLG2的結構模式圖

有別於過去研究發現的受體激酶基於同型二聚或多聚來識別配體的傳統模式，本項研究揭示的受體激酶與膜錨定蛋白形成異型複合物識別配體的模式，為植物受體激酶以及膜錨定蛋白的結構功能研究提供了全新的範例。本項研究也糾正了植物Malectin也會識別多糖的認識，證明了動植物Malectin結構域在分別進化後，已獲得了截然不同的配體識別功能。

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關鍵字: 鄭州 真菌 施一公