RNA可编程DNA核酸内切酶Cas9广泛用于需要高度特异性的基因组工程。但是对于 Cas9的哪些特征决定了对沿着靶DNA的错配的敏感性，还不是很清楚。
2020年3月2日，德国马克斯·普朗克病原学研究所Emmanuelle Charpentier团队在Nature Chemical Biology 在线发表题为“Bridge helix arginines play a critical role in Cas9 sensitivity to mismatches”的研究论文，该研究发现Cas9桥-螺旋中的精氨酸影响sgRNA，以及目标DNA结合和裂解。它们分为两组，分别增加或降低Cas9对错配的敏感性。
该研究显示桥-螺旋对于R环形成必不可少，并且R63和R66通过在存在错配的情况下稳定R环来降低Cas9特异性。此外，Q768可以降低Cas9对PAM-远端错配的敏感性。Cas9_R63A / Q768A变体在人类细胞中显示出更高的特异性。该研究结果为功能和结构指导的诱变，增加基因组工程的Cas9特异性提供了坚实的基础。
Cas9是一种RNA引导的核酸内切酶，可特异性结合并切割DNA，与位于原间隔子相邻基序（PAM）上游的CRISPR RNA（crRNA）的间隔区序列互补。双RNA（与crRNA复合的反式激活crRNA（tracrRNA））或单向导RNA（与crRNA融合的sgRNA，tracrRNA）的crRNA间隔子与目标DNA链的足够碱基配对会导致非目标链的置换和R环形成。完成此过程后，Cas9核酸内切酶结构域HNH和RuvC分别切割目标链和非目标链，导致双链DNA 断裂。由于其可编程性，CRISPR-Cas9适用于多种基因组工程方法。但是，CRISPR-Cas9技术的主要应用阻碍是Cas9切割错配的靶标时发生脱靶切割。因此，至关重要的是确定决定Cas9特异性的区域和氨基酸。
化脓性链球菌Cas9（SpCas9）需要与PAM相邻的10-12个碱基对（bp）的种子序列配对才能成功切割。REC3结构域可感知PAM远端错配并控制HNH结构域向活性构象的转变，该结构可作为在存在错配时阻止切割的机制。除减少脱靶切割的其他策略外，结构导向诱变和随机诱变都已用于产生增强的Cas9变异特异性。
eSpCas9和SpCas9-HF1在crRNA和目标DNA之间需要一个额外的碱基对，以实现稳定结合，这使目标解链对错配更加敏感，并在错配的情况下减慢切割速度。结果表明，桥-螺旋环区域中两个残基的突变会削弱靶标的裂解并提高特异性。切割前通过HNH结构域的构象检查点和种子序列是Cas9唯一已知的特异性决定因素。此外，稳定的R环形成是裂解的必要先决条件，但尚未鉴定出参与此过程的残基。因此，该研究调查了其他Cas9域是否参与了错配检测和R环稳定化，重点是目标的PAM相邻区域。
该研究表明，Cas9桥-螺旋的精氨酸影响sgRNA结合，以及目标DNA结合和裂解。该研究证明R63，R66和R70在PAM相邻错配的存在下稳定R环，从而降低了Cas9特异性。该研究结果阐明了Cas9介导的PAM相邻错配的感应基础，并建立了一个框架，以进一步提高Cas9在基因组工程应用中的特异性。
参考消息：
https://doi.org/10.1038/s41589-020-0490-4
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