在生活中，隨機性無處不在，一切都充滿了不確定性。突如其來的變化，總是讓我們猝不及防，但未必狼狽不堪。讓人害怕的壓力、挑戰、混亂，其實是滋生反脆弱的武器，能讓你變得更強大。——《反脆弱》
中國的科學界傳來喜訊，非洲豬瘟疫苗創制成功，向產業化應用邁出堅實一步。中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所在SCIENCE CHINA Life Sciences(《中國科學：生命科學》英文版)在線發表了題為“A seven-gene-deleted African swine fever virus is safe and effective as a live attenuated vaccine in pigs”的研究論文。
該研究的大致思路如下：
研究人員以我國第一株非洲豬瘟病毒分離株Pig/HLJ/2018為骨架，利用同源重組技術構建幾種缺失基因的弱毒活疫苗，並用熒光蛋白替換缺失部分作為標記。通過在豬體內進行的系統的致病力、免疫原性和免疫保護性試驗，遴選出一株具有7個基因缺失的病毒（HLJ/18-7GD）符合弱毒活疫苗安全性標準，且缺失7個基因的病毒（HLJ/18-7GD）減毒徹底，不會出現返祖現象可對非洲豬瘟強毒的致死性攻擊提供有效免疫保護。
但值得提示的是：本次的研究對象為我國第一株非洲豬瘟病毒分離株Pig/HLJ/2018為骨架，但AFS有多個基因型，本次的研究尚未針對所有的基因和血清型，未來的實用價值存疑。
研究的摘要中文版翻譯如下：
非洲豬瘟是一種毀滅性的豬傳染病，嚴重威脅著全球養豬業，亟需有效的疫苗。本文我們用中國的ASFVHLJ/18作為依託，產生了一系列基因缺失的病毒。我們對無特定病原體的豬、商品豬和妊娠母豬的毒力、免疫原性、安全性和保護效力進行評估表明，一種缺失了7個基因的病毒，即HLJ/18-7GD，在豬體內中被完全稀釋，不能轉化成其他病毒，並且提供了完整的保護。我們的研究表明，HLJ/-18-7GD是一種安全有效的對抗ASFV的疫苗，因此有望在控制ASFV的傳播中發揮重要作用。
非洲豬瘟(ASF)是一種嚴重的豬傳染病，對全球養豬業來說是一場災難。病原體——ASF病毒(ASFV)，屬於禽流感病毒家族的一員。一個大的雙鏈DNA基因組(170-193 kb)，包含151-167個基因。根據編碼衣殼蛋白p72的B646L基因，ASFs被分為24種不同的基因型，且都在非洲被檢測到，其中兩個ASFV基因型已經傳播到其他大陸。基因型一於1950年代在歐洲出現，並於1990年代中期在大多數歐洲國家被根除。基因型二ASFV於2007年引入佐治亞州，此後在許多歐洲國家流行2018年，該病毒在中國和其他10個亞洲國家傳播給豬。
中國養豬產業佔全球的50%以上；然而，中國99%以上的養豬場都是小規模農場，每年生產不到500頭豬，這些農場沒有安全措施。儘管急性豬瘟的爆發似乎是通過屠宰受感染的豬來控制的。
由於沒有疫苗可用，豬的恢復生產不太可能成功。與2018年8月相比，2019年9月中國生豬產量下降了40%，豬肉價格自2019年8月以來上漲了一倍，其他亞洲國家的情況類似。這些事實表明，僅僅通過撲殺被感染的豬是無法控制AFS傳播，迫切需要開發和應用一種有效的疫苗。在過去的幾十年裡，已經對不同的疫苗策略進行了評估。滅活疫苗、脫氧核糖核酸疫苗、亞單位疫苗和腺病毒載體疫苗已被測試並證明不成功。一些基因缺失的抗體顯示出作為減毒活疫苗的潛力，但尚不清楚它們在豬體內複製時是否能轉化成更強的毒株。在本研究中，我們選擇了中國第一個ASFV分離株，2018 (HLJ/18)，作為研製減毒活疫苗的骨幹。
具有不同基因缺失的反義寡核苷酸的產生和毒力評估使用一種DNA同源重組技術，我們通過刪除編碼一至七種不同蛋白質的基因片段構建了六種不同的病毒，包括MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、CD2v、9GL、DP148R和UK，這些基因片段先前已被證明對不同反義寡核苷酸的毒力是重要的。攜帶一個或兩個報告基因GFP和mCherry的基因缺失病毒在原代豬肺泡巨噬細胞(PAMs)中純化，通過序列分析證實，並命名為HLJ/18-6GD、HLJ/18-CD2vdel、HLJ/18-DP148R-del、HLJ/18-9GL&UK-del、HLJ/18-CD2v&UK-del和HLJ/18-7GD。
重磅發現：HLJ/18病毒對豬的致死率很高，其50%的豬致死劑量(PLD50)是1.7-50%的血液吸收劑量(HAD50)。為了研究基因缺失的病毒是否在豬中減毒，我們將3至6只7周齡的無特異性病原體(SPF)豬的組肌肉注射103和105 TCID50的基因缺失的病毒，並觀察豬3周。接種後21天監測體溫和存活率。接種了HLJ/18DP148Rdel的所有豬都出現發熱並在9天內死亡，接種了HLJ/18-CD2v-del或HLJ/18CD2v&UK-del的50%–100%的豬出現發熱，這些組中的50%–75%的豬在3周的觀察期內死亡，而接種了HLJ/18-6GD、HLJ/ 18-9GL&UK-del或HLJ/18-7GD的所有豬都保持健康並存活了3周。這些結果表明，HLJ/18DP148R-del對豬是致命的，HLJ/18-CD2v-del和HLJ/18-CD2V & UK-del對豬是輕度減毒的，HLJ/ 18-6GD、HLJ/18-9GL&UK-del和HLJ/18-7GD對豬是顯著減毒的。
由於非洲豬瘟病毒（ASFV）中有幾個基因可以確定與毒性產生有關，那麼意味著缺乏這些基因的病毒已被評估為可能的疫苗，但如何刪除相關毒性基因是我們研究重點。根據以前研究發現，刪除9GL和UK基因的ASFV Georgia/2007(基因型ii株)是安全的，可以保護豬免受同源病毒的挑戰，且刪除9GL和UK基因的HLJ/18病毒在豬中毒性表現減弱，但沒有對同源病毒的挑戰提供任何保護。這表明，不同菌株之間，ASFV毒力的分子基礎可能不同，一個菌株基因缺失引起的生物學變化可能與其他菌株不相同。
有研究發現，刪除MGF360和MGF505基因的HLJ/18-6GD在豬中也被減毒，且保護豬不受毒性親本病毒的攻擊。然而我們的安全評價數據表明，HLJ/18-6GD具有很高風險會轉化成強病毒，因此不應用作疫苗。幸運的是，對於HLJ/18-7GDvirus，這種風險已經通過刪除CD2vgene而消除。
有研究表明，ASF疫苗在細胞中適應後很容易失去免疫原性，並且不能保護豬免受同源病毒的攻擊，這可能限制ASF疫苗應在原代細胞中大規模生產，但豬骨髓(PBM)細胞支持ASFV複製。我們發現PBM對HLJ/18-7GD生長有促進作用，以及至少20萬劑疫苗（106TCID50/劑）可從一頭SPF仔豬的PBMs中生產。此外HLJ/18-7GD保持了在PBMs中連續傳代6代後的免疫原性。因此，採用PBMs大規模生產HLJ/18-7GD是可行和經濟的。總之，我們使用中國ASFVHLJ/18作為骨幹產生6種不同基因缺失的病毒，並發現HLJ/18-7GD，其具有7個基因缺失，在豬體內完全減弱，轉化為無毒菌株的風險低。HLJ/-18-7GD已經經過全面評估，並被證明是安全有效的針對ASFV。因而我們希望該疫苗在控制ASFV上發揮重要作用。
研究結果及過程
不同基因缺失下非瘟病毒的代際及毒力評價
採用DNA同源重組技術，我們通過刪除七種不同的蛋白質的基因編碼構造了六種不同的病毒，包括MGF505-1R，MGF505-2R, MGF505-3R, MGF360-12L, MGF360-13L, MGF360-14L, CD2v, 9GL, DP148R和UK。它們曾被證明是不同ASFVs毒性的重要組成，這些基因缺失病毒擁有主要由豬肺泡巨噬細胞(PAMs) 純化的1-2個報告基因GFP和mCherry，經序列分析證實，分別被設計為HLJ / 18-6GD(刪除六個蛋白質MGF505-1R、MGF505-2R MGF505-3R, MGF360-12L, MGF360-13L和MGF360-14L的基因編碼)，HLJ / 18-CD2vdel(刪除基因編碼CD2v)，HLJ / 18-DP148R-del (刪除基因編碼DP148R),HLJ / 18-9GL&UK-del (刪除基因編碼9GL和UK),HLJ / 18-CD2v&UK-del (刪除基因編碼CD2v和UK)和HLJ/18-7GD(刪除基因編碼MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、CD2v)(圖1A)。
圖1：不同基因缺失的非洲豬瘟病毒(ASFVs)的產生及毒力評價。A、基因的示意圖以及每個基因刪除的ASFV中所刪除的區域，刪除的基因片段被替換為p72eGFP、eGFP或p72mCherry報告基因表示。感染病毒的豬肺泡巨噬細胞表達不同的熒光，如圖右側所示。核苷酸指出了與ASFV HLJ/18基因組相關的缺失邊界位置。B、接種野生型的豬存活率ASFV HLJ/18和不同基因刪除的ASFVs。
HLJ/18病毒對豬具有的高致命性，其50%的致死劑量(PLD50)是1.750%的吸附劑量(HAD50)(圖1B)。為了研究這些基因缺失病毒在豬體內是否被減毒，我們肌肉注射了三到六組7周齡的無特定致病性(SPF)豬，分別注射了103和105TCID50基因缺失病毒，並對豬進行了三週的觀察，觀察接種後21天的體溫和存活率。如圖1B所示，所有接種HLJ/18- dp148的豬均於接種後9天內發燒並死亡；50%-100%的豬在接種HLJ/18-CD2v-del或HLJ/18-CD2v&UK-del三週內發燒，其中50% -75%的豬死亡；而所有的豬接種HLJ/18-6GD HLJ/18-9GL&UK-del或HLJ/18-7GD仍然健康，在為期三週的觀察期內活下來(圖1B,表1)。這些結果表明，HLJ / 18-DP148R-del對豬致命,HLJ/18-CD2v-del和HLJ/18-CD2v&UK-del對豬略減毒,HLJ/18-6GD、HLJ/18-9GL&UK-del和HLJ/18-7GD在豬體內毒性均顯著減弱。
減毒後的HLJ/18非瘟病毒對豬的保護作用
為探討減毒後的病毒是否能誘導保護性免疫，分別用200 PLD50的HLJ/18-6gd-、HLJ/18- 9gl&ukdel-和HLJ/18-7gd-接種豬肌肉內；SPF值為40周齡的豬作為對照也受到了類似的注射。記錄21天內每天的體溫和存活率。收集死亡及倖存的豬的血液、器官和組織包括心臟、肺、脾、扁桃體、胸腺和五個淋巴結，這是在接種21天內病毒DNA的 qPCR量化。對照組和HLJ/18- 9gl&uk -del- de接種組均出現發熱，均於接種後12天內死亡(圖2A)；在這些豬的血液、器官和組織中檢測到病毒DNA的高複製量(圖2B和C)。HLJ/18-6GD和HLJ/18- 7gd接種組的豬均在觀察期內存活 (圖2A)；病毒DNA在這些組的一些器官及組織中均有發現（圖2D和2E）。值得注意的是，HLJ/18- 7gd接種組的病毒DNA複製量低於其他組。103 TCID50 及105 TCID50 HLJ / 18-6GD組中各有一隻豬出現發燒，持續了9天和6天(表2)。在103 TCID50 HLJ / 18-7GD的所有四隻豬出現發燒，但是隻有一隻豬在105 TCID50 HLJ / 18-7GD組發熱1天(表2)。這些結果表明，HLJ / 18-9GL&UK-del不引發任何免疫保護，而HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD是免疫原性的，能夠保護豬抵抗致命的非瘟病毒挑戰。這些數據也表明HLJ/18-7GD的保護作用與劑量有關，而HLJ/18-6GD的保護作用與劑量無關。
圖2：不同基因缺失的ASFVs對豬的保護作用。接種了103或105的特定致病性的豬提示基因缺失的ASFVs的TCID50在肌內接種具有致死的ASFV HLJ/18。指示樣本為在第21天被實施安樂死的死豬或倖存的豬病毒DNA檢測結果。A，豬的存活率。B-E,對照組豬病毒DNA的檢測，HLJ/18-9GL&UKdel-接毒組，HLJ/18- 6gd -接毒組，HLJ/18-7GD-接毒組。虛線表示的是的下限檢測。紅色星號表示有些血液樣本沒有從死於夜間的豬身上收集。
HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD在豬體內的安全性評價
減毒活疫苗的最大的擔憂在於疫苗毒株是否可以轉換為一個強毒株用於接種動物。因兩個由衰減強毒株通過串行通道在細胞培養或自然孤立無毒株的早期活疫苗，在1960年代葡萄牙和西班牙的豬身上轉換成致命的毒株，造成10% -50%的死亡率。根據減活疫苗在中國的發展指引(http://www.moa.gov.cn)，疫苗必須連續通過目標動物5代來評估是否會有效地複製或變成比原來更致命的毒株。為此，6只SPF豬分別用107 TCID50分別接種HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD病毒，觀察21天。分別於第5、10、15天採集豬血標本，於第21天死亡的每隻豬取脾及淋巴結，用qPCR檢測病毒DNA。HLJ/18-6GD,病毒DNA檢測血液中的五隻豬和豬的脾(表3)。然而,在接種HLJ/18-7GD的組別中, 沒有任何樣本檢測到病毒DNA (表3)。所有豬在持續三星期的觀察期倖存下來。
接下來，我們將HLJ/18- 6GD組的豬身上的陽性血液注射到另外4只豬身上，第5、10和15天再次採集血樣，收集第21天死亡的每隻豬的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、扁桃體、胸腺和淋巴結等器官和組織，檢測病毒DNA。我們發現HLJ / 18-6GD病毒在豬群中能更有效地逐步複製，因病毒DNA的複製數量在接種後在血液和組織分佈中逐步增加(表3,圖3A-D)。值得注意的是，一隻豬在通過5代組接種HLJ/18-6GD病毒的發生嚴重疾病並於11天后死亡 (圖3 F,表3)。在接種5天后收集血液，從這豬接種到另外五隻豬，所有這些豬的血液及器官中均出現高濃度的病毒DNA，在接種13天后，四隻出現發燒,一隻出現了嚴重疾病症狀並死亡(圖3 E和F,表3)。這些結果表明，HLJ / 18-6GD病毒在複製的時候有可能變得致命。
我們也隨機地將接種過HLJ / 18-7GD的豬陰性血注射到另外4只豬體內，但從這些豬身上並未檢測到任何病毒DNA (表3)。為了進一步調查HLJ / 18-7GD在豬體內的複製，14只7周大的SPF豬被注射了高劑量的107.7 TCID50的病毒,分別有兩頭豬被安樂死於第2、5、8、10、12、16和21天，收集這些豬的血液和器官進行病毒DNA檢測，如圖3所示。病毒DNA未在任何豬的血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、扁桃體或胸腺中檢測到，但在5日、8日、10日、12日和16日死亡的豬的一些淋巴結中檢測到(圖3G)。
病毒DNA複製數最高的淋巴結均被均質化，並接種到另外4頭豬身上，第8天處死2頭豬，第10天處死2頭豬。收集這些豬的血液、器官和淋巴結進行病毒DNA檢測，如圖3H所示。在第10天處死的一隻豬的兩個淋巴結中檢測到病毒DNA (圖3H)，但是在隨後接種病毒DNA陽性淋巴結勻漿的豬中未檢測到該病毒(數據未顯示)。這些結果表明，肌肉注射後，HLJ/18-7GD病毒僅在豬的某些淋巴結中維持較短的時間，在豬的血液或任何其他器官中均未出現；因此，HLJ/18-7GD在豬體內的複製過程中不太可能轉化為毒性毒株。基於這些安全性評估，我們選擇HLJ/18-7GD病毒作為ASF的疫苗株，並在無病毒的商品豬上進行了額外的研究。
HLJ/18- 7GD對商品豬HLJ/18毒力的保護作用
由於單劑疫苗引起的保護性免疫在幾周內可能下降，因此在實際的動物疾病控制實踐中可能需要第二劑疫苗。除肌內攻毒外，我們還評估了口服攻毒對豬的保護作用，因口服攻毒是豬在自然界中主要感染ASFV的途徑。來自當地農場的7周齡仔豬被轉移到P2設施，接種一到兩次(間隔3周)，接種105TCID50疫苗，然後在接種後的不同時間點轉移到P4設施。4 - 5只年齡相仿的未接種疫苗的豬作為對照組。所有豬在接受HLJ/18病毒攻擊後觀察3周。收集死豬和倖存豬的血液、心臟、脾臟、肺、扁桃體、胸腺和淋巴結樣本，用qPCR進行病毒DNA檢測。值得注意的是，所有攻毒研究的對照組豬均在攻毒後11天內死亡，在這些豬的所有器官中檢測到高病毒DNA複製數(圖4，表4)。
如圖4A所示，豬在接種一劑105 TCID50疫苗後28天再接種200 PLD50 HLJ / 18，所有豬都在三星期的觀察期內存活下來，但在5只豬中的一隻中，在血液、扁桃體和兩個淋巴結中檢測出了病毒DNA (圖4A)，這表明HLJ / 18-7GD在養殖和SPF豬均提供了類似的保護。
兩組豬分別接種兩次105TCID50疫苗：，第一組接種200 PLD50劑量的 HLJ/18，第二週第二次接種；第二組接種106.5 HAD50劑量的HLJ/18，第三週第二次接種。所有接種疫苗的豬均存活3周觀察期，在攻毒組一隻豬的一個淋巴結中檢測到極低水平的病毒DNA(圖4B)；未檢測到任何口服組豬的病毒DNA(圖4C)。這些結果表明，兩次免疫105TCID50HLJ/18-7GD可以對豬的HLJ/18致死挑戰提供堅實的保護。
商品豬通常至少要飼養5個月。當我們對一群在5個月大時接種兩次105TCID50 HLJ/18-7GD的豬進行測試時，我們發現, 80%的豬倖存了下來，但持久的免疫力無法有效地挑戰病毒(圖S1)。從圖2的數據可以看出，HLJ/18-7GD對機體的保護作用是與劑量相關的，因此，我們研究了更高的接種劑量是否可以產生更好的長期保護作用。為此，我們給6頭豬接種了1劑106TCID50疫苗，並在接種後10周對豬進行測試。我們發現，所有接種疫苗的豬在觀察期間都保持健康並存活了下來，並且在兩隻不同的豬的一個淋巴結中檢測到低水平的病毒DNA，而在另外四隻豬中沒有檢測到(圖4D)。這些結果表明，單劑量HLJ/18-7GD的106TCID50可對豬的ASFV致死性免疫產生較好的保護作用，暗示兩劑量HLJ/18-7GD的106TCID50可對豬產生終生保護作用。
HLJ/18-7GD在妊娠母豬中的安全性評價
在實踐中，為了控制ASF，母豬也需要接種疫苗。接種疫苗總是有可能在懷孕期間引起問題。因此，我們調查了疫苗在懷孕母豬中的安全性。六隻初產的母豬在不同懷孕階段接種106 TCID50 HLJ / 18-7GD：一隻母豬接種在懷孕35天(早期妊娠)，兩隻母豬接種的第94天懷孕(懷孕晚期)，三個母豬接種在懷孕的第63天(懷孕中期)。對照組為2頭母豬(表5)。從接種日起至仔豬分娩後四周，每天對妊娠母豬進行監測。所有母豬接種後均保持健康，並在預定日期分娩(表5)，說明接種HLJ/18-7GD不會引起妊娠母豬疾病或流產，也不會影響仔豬健康。
事件點評
事件評論：疫苗的研製成功或首先刺激養殖戶將商品母豬留種做三元母豬的積極性，從母豬仔需8個月到可繁育狀態，母豬從妊娠到產仔則需要114天左右，豬仔斷奶需21-35天，所以母豬一年可育大約2.4胎，豬仔大約需要6個月左右時間，體重漲至120千克出欄。雖然疫苗並未提及用於商用的時間表，但邊際好轉出現，按此推算今年4季度末到明年2季度或出現國內生豬存欄的快速增長，今年2季度初出現存欄低位，並逐步恢復。
此外，在國內新冠疫情期間受調運難，運力緊張等因素約束，國內的生豬補欄進度緩慢，這或在未來出現明顯改觀，AFS和新冠疫情逐步可控的趨勢下，生豬的補欄預期將快速被市場認可，後期豆粕，菜粕和玉米等消費看漲，中國對全球大豆的進口需求有望止住美豆的超跌狀態，且超跌的蛋白粕或開啟反彈，建議考慮豆粕2009合約的虛值看漲、菜粕2005合約、玉米2009合約的逢低佈局。
作者姓名：田亞雄
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