在生活中，随机性无处不在，一切都充满了不确定性。突如其来的变化，总是让我们猝不及防，但未必狼狈不堪。让人害怕的压力、挑战、混乱，其实是滋生反脆弱的武器，能让你变得更强大。——《反脆弱》
中国的科学界传来喜讯，非洲猪瘟疫苗创制成功，向产业化应用迈出坚实一步。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在SCIENCE CHINA Life Sciences(《中国科学：生命科学》英文版)在线发表了题为“A seven-gene-deleted African swine fever virus is safe and effective as a live attenuated vaccine in pigs”的研究论文。
该研究的大致思路如下：
研究人员以我国第一株非洲猪瘟病毒分离株Pig/HLJ/2018为骨架，利用同源重组技术构建几种缺失基因的弱毒活疫苗，并用荧光蛋白替换缺失部分作为标记。通过在猪体内进行的系统的致病力、免疫原性和免疫保护性试验，遴选出一株具有7个基因缺失的病毒（HLJ/18-7GD）符合弱毒活疫苗安全性标准，且缺失7个基因的病毒（HLJ/18-7GD）减毒彻底，不会出现返祖现象可对非洲猪瘟强毒的致死性攻击提供有效免疫保护。
但值得提示的是：本次的研究对象为我国第一株非洲猪瘟病毒分离株Pig/HLJ/2018为骨架，但AFS有多个基因型，本次的研究尚未针对所有的基因和血清型，未来的实用价值存疑。
研究的摘要中文版翻译如下：
非洲猪瘟是一种毁灭性的猪传染病，严重威胁着全球养猪业，亟需有效的疫苗。本文我们用中国的ASFVHLJ/18作为依托，产生了一系列基因缺失的病毒。我们对无特定病原体的猪、商品猪和妊娠母猪的毒力、免疫原性、安全性和保护效力进行评估表明，一种缺失了7个基因的病毒，即HLJ/18-7GD，在猪体内中被完全稀释，不能转化成其他病毒，并且提供了完整的保护。我们的研究表明，HLJ/-18-7GD是一种安全有效的对抗ASFV的疫苗，因此有望在控制ASFV的传播中发挥重要作用。
非洲猪瘟(ASF)是一种严重的猪传染病，对全球养猪业来说是一场灾难。病原体——ASF病毒(ASFV)，属于禽流感病毒家族的一员。一个大的双链DNA基因组(170-193 kb)，包含151-167个基因。根据编码衣壳蛋白p72的B646L基因，ASFs被分为24种不同的基因型，且都在非洲被检测到，其中两个ASFV基因型已经传播到其他大陆。基因型一于1950年代在欧洲出现，并于1990年代中期在大多数欧洲国家被根除。基因型二ASFV于2007年引入佐治亚州，此后在许多欧洲国家流行2018年，该病毒在中国和其他10个亚洲国家传播给猪。
中国养猪产业占全球的50%以上；然而，中国99%以上的养猪场都是小规模农场，每年生产不到500头猪，这些农场没有安全措施。尽管急性猪瘟的爆发似乎是通过屠宰受感染的猪来控制的。
由于没有疫苗可用，猪的恢复生产不太可能成功。与2018年8月相比，2019年9月中国生猪产量下降了40%，猪肉价格自2019年8月以来上涨了一倍，其他亚洲国家的情况类似。这些事实表明，仅仅通过扑杀被感染的猪是无法控制AFS传播，迫切需要开发和应用一种有效的疫苗。在过去的几十年里，已经对不同的疫苗策略进行了评估。灭活疫苗、脱氧核糖核酸疫苗、亚单位疫苗和腺病毒载体疫苗已被测试并证明不成功。一些基因缺失的抗体显示出作为减毒活疫苗的潜力，但尚不清楚它们在猪体内复制时是否能转化成更强的毒株。在本研究中，我们选择了中国第一个ASFV分离株，2018 (HLJ/18)，作为研制减毒活疫苗的骨干。
具有不同基因缺失的反义寡核苷酸的产生和毒力评估使用一种DNA同源重组技术，我们通过删除编码一至七种不同蛋白质的基因片段构建了六种不同的病毒，包括MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、CD2v、9GL、DP148R和UK，这些基因片段先前已被证明对不同反义寡核苷酸的毒力是重要的。携带一个或两个报告基因GFP和mCherry的基因缺失病毒在原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中纯化，通过序列分析证实，并命名为HLJ/18-6GD、HLJ/18-CD2vdel、HLJ/18-DP148R-del、HLJ/18-9GL&UK-del、HLJ/18-CD2v&UK-del和HLJ/18-7GD。
重磅发现：HLJ/18病毒对猪的致死率很高，其50%的猪致死剂量(PLD50)是1.7-50%的血液吸收剂量(HAD50)。为了研究基因缺失的病毒是否在猪中减毒，我们将3至6只7周龄的无特异性病原体(SPF)猪的组肌肉注射103和105 TCID50的基因缺失的病毒，并观察猪3周。接种后21天监测体温和存活率。接种了HLJ/18DP148Rdel的所有猪都出现发热并在9天内死亡，接种了HLJ/18-CD2v-del或HLJ/18CD2v&UK-del的50%–100%的猪出现发热，这些组中的50%–75%的猪在3周的观察期内死亡，而接种了HLJ/18-6GD、HLJ/ 18-9GL&UK-del或HLJ/18-7GD的所有猪都保持健康并存活了3周。这些结果表明，HLJ/18DP148R-del对猪是致命的，HLJ/18-CD2v-del和HLJ/18-CD2V & UK-del对猪是轻度减毒的，HLJ/ 18-6GD、HLJ/18-9GL&UK-del和HLJ/18-7GD对猪是显著减毒的。
由于非洲猪瘟病毒（ASFV）中有几个基因可以确定与毒性产生有关，那么意味着缺乏这些基因的病毒已被评估为可能的疫苗，但如何删除相关毒性基因是我们研究重点。根据以前研究发现，删除9GL和UK基因的ASFV Georgia/2007(基因型ii株)是安全的，可以保护猪免受同源病毒的挑战，且删除9GL和UK基因的HLJ/18病毒在猪中毒性表现减弱，但没有对同源病毒的挑战提供任何保护。这表明，不同菌株之间，ASFV毒力的分子基础可能不同，一个菌株基因缺失引起的生物学变化可能与其他菌株不相同。
有研究发现，删除MGF360和MGF505基因的HLJ/18-6GD在猪中也被减毒，且保护猪不受毒性亲本病毒的攻击。然而我们的安全评价数据表明，HLJ/18-6GD具有很高风险会转化成强病毒，因此不应用作疫苗。幸运的是，对于HLJ/18-7GDvirus，这种风险已经通过删除CD2vgene而消除。
有研究表明，ASF疫苗在细胞中适应后很容易失去免疫原性，并且不能保护猪免受同源病毒的攻击，这可能限制ASF疫苗应在原代细胞中大规模生产，但猪骨髓(PBM)细胞支持ASFV复制。我们发现PBM对HLJ/18-7GD生长有促进作用，以及至少20万剂疫苗（106TCID50/剂）可从一头SPF仔猪的PBMs中生产。此外HLJ/18-7GD保持了在PBMs中连续传代6代后的免疫原性。因此，采用PBMs大规模生产HLJ/18-7GD是可行和经济的。总之，我们使用中国ASFVHLJ/18作为骨干产生6种不同基因缺失的病毒，并发现HLJ/18-7GD，其具有7个基因缺失，在猪体内完全减弱，转化为无毒菌株的风险低。HLJ/-18-7GD已经经过全面评估，并被证明是安全有效的针对ASFV。因而我们希望该疫苗在控制ASFV上发挥重要作用。
研究结果及过程
不同基因缺失下非瘟病毒的代际及毒力评价
采用DNA同源重组技术，我们通过删除七种不同的蛋白质的基因编码构造了六种不同的病毒，包括MGF505-1R，MGF505-2R, MGF505-3R, MGF360-12L, MGF360-13L, MGF360-14L, CD2v, 9GL, DP148R和UK。它们曾被证明是不同ASFVs毒性的重要组成，这些基因缺失病毒拥有主要由猪肺泡巨噬细胞(PAMs) 纯化的1-2个报告基因GFP和mCherry，经序列分析证实，分别被设计为HLJ / 18-6GD(删除六个蛋白质MGF505-1R、MGF505-2R MGF505-3R, MGF360-12L, MGF360-13L和MGF360-14L的基因编码)，HLJ / 18-CD2vdel(删除基因编码CD2v)，HLJ / 18-DP148R-del (删除基因编码DP148R),HLJ / 18-9GL&UK-del (删除基因编码9GL和UK),HLJ / 18-CD2v&UK-del (删除基因编码CD2v和UK)和HLJ/18-7GD(删除基因编码MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、CD2v)(图1A)。
图1：不同基因缺失的非洲猪瘟病毒(ASFVs)的产生及毒力评价。A、基因的示意图以及每个基因删除的ASFV中所删除的区域，删除的基因片段被替换为p72eGFP、eGFP或p72mCherry报告基因表示。感染病毒的猪肺泡巨噬细胞表达不同的荧光，如图右侧所示。核苷酸指出了与ASFV HLJ/18基因组相关的缺失边界位置。B、接种野生型的猪存活率ASFV HLJ/18和不同基因删除的ASFVs。
HLJ/18病毒对猪具有的高致命性，其50%的致死剂量(PLD50)是1.750%的吸附剂量(HAD50)(图1B)。为了研究这些基因缺失病毒在猪体内是否被减毒，我们肌肉注射了三到六组7周龄的无特定致病性(SPF)猪，分别注射了103和105TCID50基因缺失病毒，并对猪进行了三周的观察，观察接种后21天的体温和存活率。如图1B所示，所有接种HLJ/18- dp148的猪均于接种后9天内发烧并死亡；50%-100%的猪在接种HLJ/18-CD2v-del或HLJ/18-CD2v&UK-del三周内发烧，其中50% -75%的猪死亡；而所有的猪接种HLJ/18-6GD HLJ/18-9GL&UK-del或HLJ/18-7GD仍然健康，在为期三周的观察期内活下来(图1B,表1)。这些结果表明，HLJ / 18-DP148R-del对猪致命,HLJ/18-CD2v-del和HLJ/18-CD2v&UK-del对猪略减毒,HLJ/18-6GD、HLJ/18-9GL&UK-del和HLJ/18-7GD在猪体内毒性均显著减弱。
减毒后的HLJ/18非瘟病毒对猪的保护作用
为探讨减毒后的病毒是否能诱导保护性免疫，分别用200 PLD50的HLJ/18-6gd-、HLJ/18- 9gl&ukdel-和HLJ/18-7gd-接种猪肌肉内；SPF值为40周龄的猪作为对照也受到了类似的注射。记录21天内每天的体温和存活率。收集死亡及幸存的猪的血液、器官和组织包括心脏、肺、脾、扁桃体、胸腺和五个淋巴结，这是在接种21天内病毒DNA的 qPCR量化。对照组和HLJ/18- 9gl&uk -del- de接种组均出现发热，均于接种后12天内死亡(图2A)；在这些猪的血液、器官和组织中检测到病毒DNA的高复制量(图2B和C)。HLJ/18-6GD和HLJ/18- 7gd接种组的猪均在观察期内存活 (图2A)；病毒DNA在这些组的一些器官及组织中均有发现（图2D和2E）。值得注意的是，HLJ/18- 7gd接种组的病毒DNA复制量低于其他组。103 TCID50 及105 TCID50 HLJ / 18-6GD组中各有一只猪出现发烧，持续了9天和6天(表2)。在103 TCID50 HLJ / 18-7GD的所有四只猪出现发烧，但是只有一只猪在105 TCID50 HLJ / 18-7GD组发热1天(表2)。这些结果表明，HLJ / 18-9GL&UK-del不引发任何免疫保护，而HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD是免疫原性的，能够保护猪抵抗致命的非瘟病毒挑战。这些数据也表明HLJ/18-7GD的保护作用与剂量有关，而HLJ/18-6GD的保护作用与剂量无关。
图2：不同基因缺失的ASFVs对猪的保护作用。接种了103或105的特定致病性的猪提示基因缺失的ASFVs的TCID50在肌内接种具有致死的ASFV HLJ/18。指示样本为在第21天被实施安乐死的死猪或幸存的猪病毒DNA检测结果。A，猪的存活率。B-E,对照组猪病毒DNA的检测，HLJ/18-9GL&UKdel-接毒组，HLJ/18- 6gd -接毒组，HLJ/18-7GD-接毒组。虚线表示的是的下限检测。红色星号表示有些血液样本没有从死于夜间的猪身上收集。
HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD在猪体内的安全性评价
减毒活疫苗的最大的担忧在于疫苗毒株是否可以转换为一个强毒株用于接种动物。因两个由衰减强毒株通过串行通道在细胞培养或自然孤立无毒株的早期活疫苗，在1960年代葡萄牙和西班牙的猪身上转换成致命的毒株，造成10% -50%的死亡率。根据减活疫苗在中国的发展指引(http://www.moa.gov.cn)，疫苗必须连续通过目标动物5代来评估是否会有效地复制或变成比原来更致命的毒株。为此，6只SPF猪分别用107 TCID50分别接种HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD病毒，观察21天。分别于第5、10、15天采集猪血标本，于第21天死亡的每只猪取脾及淋巴结，用qPCR检测病毒DNA。HLJ/18-6GD,病毒DNA检测血液中的五只猪和猪的脾(表3)。然而,在接种HLJ/18-7GD的组别中, 没有任何样本检测到病毒DNA (表3)。所有猪在持续三星期的观察期幸存下来。
接下来，我们将HLJ/18- 6GD组的猪身上的阳性血液注射到另外4只猪身上，第5、10和15天再次采集血样，收集第21天死亡的每只猪的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、扁桃体、胸腺和淋巴结等器官和组织，检测病毒DNA。我们发现HLJ / 18-6GD病毒在猪群中能更有效地逐步复制，因病毒DNA的复制数量在接种后在血液和组织分布中逐步增加(表3,图3A-D)。值得注意的是，一只猪在通过5代组接种HLJ/18-6GD病毒的发生严重疾病并于11天后死亡 (图3 F,表3)。在接种5天后收集血液，从这猪接种到另外五只猪，所有这些猪的血液及器官中均出现高浓度的病毒DNA，在接种13天后，四只出现发烧,一只出现了严重疾病症状并死亡(图3 E和F,表3)。这些结果表明，HLJ / 18-6GD病毒在复制的时候有可能变得致命。
我们也随机地将接种过HLJ / 18-7GD的猪阴性血注射到另外4只猪体内，但从这些猪身上并未检测到任何病毒DNA (表3)。为了进一步调查HLJ / 18-7GD在猪体内的复制，14只7周大的SPF猪被注射了高剂量的107.7 TCID50的病毒,分别有两头猪被安乐死于第2、5、8、10、12、16和21天，收集这些猪的血液和器官进行病毒DNA检测，如图3所示。病毒DNA未在任何猪的血液、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、扁桃体或胸腺中检测到，但在5日、8日、10日、12日和16日死亡的猪的一些淋巴结中检测到(图3G)。
病毒DNA复制数最高的淋巴结均被均质化，并接种到另外4头猪身上，第8天处死2头猪，第10天处死2头猪。收集这些猪的血液、器官和淋巴结进行病毒DNA检测，如图3H所示。在第10天处死的一只猪的两个淋巴结中检测到病毒DNA (图3H)，但是在随后接种病毒DNA阳性淋巴结匀浆的猪中未检测到该病毒(数据未显示)。这些结果表明，肌肉注射后，HLJ/18-7GD病毒仅在猪的某些淋巴结中维持较短的时间，在猪的血液或任何其他器官中均未出现；因此，HLJ/18-7GD在猪体内的复制过程中不太可能转化为毒性毒株。基于这些安全性评估，我们选择HLJ/18-7GD病毒作为ASF的疫苗株，并在无病毒的商品猪上进行了额外的研究。
HLJ/18- 7GD对商品猪HLJ/18毒力的保护作用
由于单剂疫苗引起的保护性免疫在几周内可能下降，因此在实际的动物疾病控制实践中可能需要第二剂疫苗。除肌内攻毒外，我们还评估了口服攻毒对猪的保护作用，因口服攻毒是猪在自然界中主要感染ASFV的途径。来自当地农场的7周龄仔猪被转移到P2设施，接种一到两次(间隔3周)，接种105TCID50疫苗，然后在接种后的不同时间点转移到P4设施。4 - 5只年龄相仿的未接种疫苗的猪作为对照组。所有猪在接受HLJ/18病毒攻击后观察3周。收集死猪和幸存猪的血液、心脏、脾脏、肺、扁桃体、胸腺和淋巴结样本，用qPCR进行病毒DNA检测。值得注意的是，所有攻毒研究的对照组猪均在攻毒后11天内死亡，在这些猪的所有器官中检测到高病毒DNA复制数(图4，表4)。
如图4A所示，猪在接种一剂105 TCID50疫苗后28天再接种200 PLD50 HLJ / 18，所有猪都在三星期的观察期内存活下来，但在5只猪中的一只中，在血液、扁桃体和两个淋巴结中检测出了病毒DNA (图4A)，这表明HLJ / 18-7GD在养殖和SPF猪均提供了类似的保护。
两组猪分别接种两次105TCID50疫苗：，第一组接种200 PLD50剂量的 HLJ/18，第二周第二次接种；第二组接种106.5 HAD50剂量的HLJ/18，第三周第二次接种。所有接种疫苗的猪均存活3周观察期，在攻毒组一只猪的一个淋巴结中检测到极低水平的病毒DNA(图4B)；未检测到任何口服组猪的病毒DNA(图4C)。这些结果表明，两次免疫105TCID50HLJ/18-7GD可以对猪的HLJ/18致死挑战提供坚实的保护。
商品猪通常至少要饲养5个月。当我们对一群在5个月大时接种两次105TCID50 HLJ/18-7GD的猪进行测试时，我们发现, 80%的猪幸存了下来，但持久的免疫力无法有效地挑战病毒(图S1)。从图2的数据可以看出，HLJ/18-7GD对机体的保护作用是与剂量相关的，因此，我们研究了更高的接种剂量是否可以产生更好的长期保护作用。为此，我们给6头猪接种了1剂106TCID50疫苗，并在接种后10周对猪进行测试。我们发现，所有接种疫苗的猪在观察期间都保持健康并存活了下来，并且在两只不同的猪的一个淋巴结中检测到低水平的病毒DNA，而在另外四只猪中没有检测到(图4D)。这些结果表明，单剂量HLJ/18-7GD的106TCID50可对猪的ASFV致死性免疫产生较好的保护作用，暗示两剂量HLJ/18-7GD的106TCID50可对猪产生终生保护作用。
HLJ/18-7GD在妊娠母猪中的安全性评价
在实践中，为了控制ASF，母猪也需要接种疫苗。接种疫苗总是有可能在怀孕期间引起问题。因此，我们调查了疫苗在怀孕母猪中的安全性。六只初产的母猪在不同怀孕阶段接种106 TCID50 HLJ / 18-7GD：一只母猪接种在怀孕35天(早期妊娠)，两只母猪接种的第94天怀孕(怀孕晚期)，三个母猪接种在怀孕的第63天(怀孕中期)。对照组为2头母猪(表5)。从接种日起至仔猪分娩后四周，每天对妊娠母猪进行监测。所有母猪接种后均保持健康，并在预定日期分娩(表5)，说明接种HLJ/18-7GD不会引起妊娠母猪疾病或流产，也不会影响仔猪健康。
事件点评
事件评论：疫苗的研制成功或首先刺激养殖户将商品母猪留种做三元母猪的积极性，从母猪仔需8个月到可繁育状态，母猪从妊娠到产仔则需要114天左右，猪仔断奶需21-35天，所以母猪一年可育大约2.4胎，猪仔大约需要6个月左右时间，体重涨至120千克出栏。虽然疫苗并未提及用于商用的时间表，但边际好转出现，按此推算今年4季度末到明年2季度或出现国内生猪存栏的快速增长，今年2季度初出现存栏低位，并逐步恢复。
此外，在国内新冠疫情期间受调运难，运力紧张等因素约束，国内的生猪补栏进度缓慢，这或在未来出现明显改观，AFS和新冠疫情逐步可控的趋势下，生猪的补栏预期将快速被市场认可，后期豆粕，菜粕和玉米等消费看涨，中国对全球大豆的进口需求有望止住美豆的超跌状态，且超跌的蛋白粕或开启反弹，建议考虑豆粕2009合约的虚值看涨、菜粕2005合约、玉米2009合约的逢低布局。
作者姓名：田亚雄
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