「珍藏版」Nat Cell Bio綜述

幹細胞發現至今也有幾十年的時間了。其自我更新和分化潛能的特徵決定了幹細胞治療是一種非常有前景的療法。近日，幹細胞領域大咖Michele De Luca在

撰文 | 圖南

幹細胞是一類尚未完全分化的細胞，具有兩項最主要的特性：自我更新和分化潛能。幹細胞治療就是利用幹細胞的分化潛能，將健康的幹細胞移植到患者體內，進而達到組織再生修復的功能。已有的幹細胞治療可以分為自體移植和異體移植。異體移植是從健康人體內獲取所需要的幹細胞，體外進行擴增培養之後進行移植，但可能存在免疫排斥反應。自體移植則是直接從患者體內獲取幹細胞之後進行基因編輯修飾，將其轉變成健康的幹細胞之後進行移植。

近三十年來，與幹細胞治療相關的研究如火如荼，在臨床應用上展現出了一定的潛力，尤其是針對遺傳病和退行性疾病具有獨特優勢。同時，隨著細胞重編程技術和基因編輯技術的進步，成體幹細胞及體細胞誘導的多能幹細胞也將進一步助推幹細胞療法。然而，儘管近些年來與細胞治療、基因治療等相關的臨床實驗註冊數目呈現指數型增長，其中證明有效的病例數目有限，很多臨床試驗背後的科學依據並不清楚，需要更加謹慎的審視。

近日，來自意大利摩德納大學再生醫學中心的幹細胞專家Michele De Luca博士領銜在Nature Cell Biology上發表題為Advances in stem cell research and therapeuticdevelopment 的綜述，概括了近些年來基於不同類型幹細胞的臨床治療案例和一些正在進行或即將進行的臨床試驗，同時分析了這些臨床應用背後的科學依據，試驗方法以及需要提出的問題。

1

造血幹細胞

造血幹細胞移植技術也就是骨髓移植，是發展最早，也是相對而言最成熟的一種幹細胞療法，臨床上主要用於在放療或者化療之後補充體內損傷的造血幹細胞，進而重塑整個造血系統。1957年，第一批病人在放療或者化療之後接受了骨髓移植，而1968年，一個五個月大的患有嚴重複合型免疫缺陷病的小男孩成功接受了骨髓移植，成為了第一例利用造血幹細胞移植治療遺傳性疾病的成功案例。在過去的五十年間，有超過40萬人採用了骨髓移植治療造血系統的惡性腫瘤、遺傳或者獲得性的造血系統缺陷病。但是，異體造血幹細胞移植依舊存在配型困難及免疫排斥反應，這是臨床上面臨的一個重大挑戰。

基於造血幹細胞的基因療法則可以很好地解決這一問題。在這種情況下，我們可以從病人的骨髓和外周血中通過分子標記CD34進行純化，得到CD34+陽性的造血幹細胞，然後在其基因組中插入構建攜帶目標基因的病毒載體，從而得到健康的造血幹細胞回輸到病人體內。在過去的二十年間，基於造血幹細胞的基因療法成為更加有效地治療單基因遺傳疾病的方式，比如原發性的免疫缺陷病、血紅素病變及神經代謝紊亂等。歐盟在2016年批准了第一項基於造血幹細胞基因療法的產品，Strimvelis，用於治療由腺苷脫氨酶（ADA）單基因引起的嚴重複合型免疫缺陷病。預計在2020年底，另外五項基於造血幹細胞基因療法的產品在歐盟或者美國也將得以通過審批，進入臨床應用，並且還有20項針對不同基因遺傳疾病的相關的臨床試驗也在進行中。這些成功案例都很大程度上得益於幹細胞體外培養技術及轉基因技術的進步

然而，基於造血幹細胞的基因療法也有其缺陷。首先，整個治療過程步驟繁雜，涉及到細胞的收集、轉運、編輯及保存，需要建立完善的質量控制標準。其次，病人在接受移植之前，需要接受化療來清除體內原有的造血幹細胞。因此化療的劑量控制也需要制定相應的標準。更為致命的是，在使用γ-逆轉錄病毒進行基因修飾的過程中，病毒載體的增強子可能會意外激活內源性的原癌基因，進而引發惡性腫瘤。這促使大家開始轉而改用慢病毒載體進行基因修飾，降低致癌風險。目前已有超過150名涉及9種不同遺傳病的病人使用了改良版的造血幹細胞基因療法，並取得較好的效果。

此外，應用造血幹細胞的基因療法去矯正血紅細胞相關的遺傳疾病極富挑戰性，因為轉入的基因很難實現持續可控地血紅細胞中特異性表達。兩項針對β-地中海貧血症的臨床試驗中期報告顯示，接受治療的病人可以減輕或者不再需要進行長期的輸血。另外一些早期的實驗結果顯示，造血幹細胞基因療法對鐮刀形貧血症、慢性肉芽腫病和範可尼貧血症臨床試驗也有一定的效果。

近些年來，基因編輯技術的進步使得我們能夠更加準確地在基因組上特定位置進行編輯矯正，而不是單純的利用病毒過表達我們需要的基因。這能夠幫助我們長時間地追蹤移植的細胞，分析它們在病人體內分化成了哪些細胞亞群，如何重新構建造血系統等，同時也證明了造血幹細胞的分化潛能。總之，基因編輯技術的成功使得造血幹細胞基因治療更富潛力。

2

表皮幹細胞

表皮幹細胞是一類位於表皮基底層的成體幹細胞，能夠分化得到表皮中的各種細胞類型。1975年，人表皮角質形成細胞體外培養獲得成功。隨後，該細胞便被用於自體移植治療大面積的燒傷患者。目前，人表皮角質形成細胞移植已經成為三級燒傷治療的常規手段。早期研究就發現人表皮角質形成細胞中含有三種細胞類型，分別被稱為holoclone, meroclone和paraclone，其成克隆能力依次遞減，細胞乾性也隨之遞減。現在我們已經知道holoclone是表皮幹細胞移植實驗成功的關鍵所在，其他兩種類型的細胞均無法實現長期的表皮更新。

同樣，角膜緣細胞（ocular limbal cell）中也含有一種角膜上皮幹細胞，這對於眼角膜的損傷修復至關重要。角膜緣在化學灼傷的情況下會損失其幹細胞，並且在眼角膜中出現血管生成、慢性炎症、角膜混濁和球結膜侵襲等，進而引起視力下降。角膜緣細胞移植能夠有效地促進角膜再生和視力恢復。通常情況下，從患者未受傷的眼睛中提取1-2平方毫米的角膜緣就能夠進行體外培養，再生出完整的角膜上皮，進行自體移植到受傷的眼部。2015年，自體角膜緣細胞移植（Holoclar）成為歐洲第一例批准的幹細胞療法。角膜緣細胞中也含有一部分holoclone細胞，但是克隆的大小、數目和細胞生長速率均不能夠準確預測治療效果。因此，絕大部分的角膜緣細胞極有可能是瞬時的前體細胞，而不是幹細胞。而轉錄因子p63作為一個重要的調控因子，可以幫助判斷角膜緣培養中的holoclone幹細胞含量。

除了治療皮膚燒傷和眼角膜灼傷之外，表皮幹細胞自體移植也能夠與基因療法聯合起來，治療一些遺傳性疾病，例如大皰性表皮鬆解症。大皰性表皮鬆解症是一種罕見遺傳病，可細分為四種亞型，其中包括由於LAMA3/LAMB3/LAMC2等基因突變引起的交界性大皰性表皮鬆解症。由於上述三個基因的突變，患者不能夠編碼正常的層黏連蛋白332/膠原蛋白17/α6β4整聯蛋白。完全缺失層黏連蛋白332的患者都出現早期致死的情況，而在非早期致死型的患者體內層黏連蛋白332表達水平顯著降低，這使得病人在受到輕微創傷的情況下便會出現皮膚和粘膜的水皰和糜爛現象。目前沒有針對該病的有效治療手段。然而，基因療法利用γ-逆轉錄病毒將正常的LAMB3基因轉入患者的表皮幹細胞中，並且移植回病人身上，重建其皮膚組織。近期一名7歲兒童患者變受益於此療法，他的表皮細胞中已經有了正常水平的層黏連蛋白332，且有了完整的基底膜。雖然目前尚未發現該療法引起惡性腫瘤的案例，但是與造血幹細胞基因療法類似，我們仍然需要開發比γ-逆轉錄病毒更加安全的病毒載體。

對於病人的轉基因表皮幹細胞譜系分化追蹤實驗得到了三個重要結論：1. Holoclone形成細胞是表皮幹細胞移植成功所必需的；2.meroclones和paraclones是瞬時存在的前體細胞，在移植幾個月之後便會消失；3人的表皮是由少數的haloclone細胞維持的，但是這些holoclones是均一的還是具有一定的譜系尚待研究。因此，體外培養的表皮移植體中haloclone幹細胞數目的多少決定了該移植體質量。

3

肌肉乾細胞/祖細胞

儘管在結構和功能上具有一定的相似性，骨骼肌和心肌細胞從胚胎來源和再生能力上來看具有較大差異。骨骼肌細胞在急性或者慢性損傷的情況下都具有較高的修復能力，而心肌細胞不可再生，因此我們推斷骨骼肌中含有一定量的幹細胞但是心肌中並沒有（關於心肌幹細胞請閱讀BioArt報道：NBT特別關注丨6位大咖指引心肌幹細胞領域“再生”）。我們目前對於心肌細胞知之甚少，並且目前所有針對心肌或者是骨骼肌相關疾病的幹細胞療法都是無效的。

就骨骼肌而言，1961年由Mauro發現的肌衛星細胞目前被認為是骨骼肌幹細胞。這群細胞位於肌肉膜和基底層之間，並且高表達Pax7。肌衛星細胞對於人體出生後的肌肉生長至關重要，但是在個體性成熟後便進入靜息狀態，只有在出現肌肉損傷的時候才會被再次激活，分化為肌原細胞修復肌肉纖維，同時自我更新，生成新的肌衛星細胞。儘管在小鼠的細胞移植實驗中，肌衛星細胞被證明是具有較強幹性的，但是它們在人體中自我更新的能力較弱。1990年，人們試圖通過移植肌衛星細胞來治療杜氏肌營養不良症。然而，雖然在患者體內檢測到了供體的肌衛星細胞核，但是移植治療並沒有效果，這很可能是由於移植進去的細胞存活率和遷移能力都較低引起的。一些針對局部性的肌肉損傷修復的肌衛星細胞移植實驗取得了一定的成效，比如括約肌失禁治療等。然而由於患者本身的多樣性，目前尚沒有明確的結論。除衛星細胞之外，肌肉中還存在其他的一些細胞類型，包括最近鑑定出來的Pw1陽性細胞。雖然它們都不是幹細胞，但是有一些細胞類群參與了肌肉的生長與修復，比如中成血管細胞。然而中成血管細胞的移植卻收效甚微，這可能是因為移植細胞的存活率太低。

與骨骼肌幹細胞不同，心肌幹細胞並沒有廣泛認可的特定細胞類型。近二十年來的研究針對不同的心血管疾病及多種細胞類型。2001年，一項充滿爭議的研究聲稱骨髓移植有利於治療心肌梗塞，然而其他課題組卻無法重複這項研究結果。人們猜想骨髓移植可能是通過旁分泌的方式促進心肌細胞的存活及血管生成來發揮作用的。另一項研究則表明，心臟細胞在發育過程中是可以分化為其他細胞的，但是這在成年人體內不會發生。利用重編程或者是胚胎幹細胞分化得到的心肌前體細胞在動物體內實驗有一定成效，能夠可控的分化成各種心臟細胞類型，但是這種技術手段仍然面臨體外細胞擴增困難及免疫排斥的問題。此外，這種途徑得到的心肌細胞只有正常心肌細胞的三分之一大小，容易引發心律失常。另一種方案是直接促進內源性的心臟再生，避免細胞移植問題。比如，激活內源性的心肌祖細胞或者誘導纖維細胞轉分化為心肌細胞，原位誘導細胞部分重編程或者使用外部的心臟補片。

總之，目前我們對於肌肉細胞的幹細胞或者是祖細胞的瞭解尚不夠深入。未來的臨床試驗還需要更加深入的基礎研究作為理論依據。

4

組織特異的幹細胞、祖細胞

Friedenstein和Owen在骨髓中發現一類具有成克隆能力，可以分化得到軟骨、骨、造血支持基質和骨髓脂肪細胞的細胞類群。鑑於這些細胞具有多能性，能夠分化得到其譜系之外的中胚層結締組織，例如肌肉、肌腱、韌帶及脂肪組織等，人們將其命名為間充質幹細胞。然而嚴格意義上講，這個名稱並不準確。首先，間充質存在於胚胎中，能夠分化得到各種結締組織，血液和血管等。任何成體幹細胞都不具有這一類特性。其次，不同的結締組織來自於不同的特化的神經嵴及中胚層細胞。無論是在胚胎髮育過程中還是出生之後的個體中，都不存在公共的間充質幹細胞。

儘管間充質幹細胞的理論基礎並不紮實，但是它們已經被用於超過900項臨床試驗，治療多種類型的疾病

事實上，所謂的間充質幹細胞中的確存在一些組織特異的幹細胞或者是前體細胞，但是它們不應該被籠統的命名為間充質幹細胞，而應該根據其來源和分化去向進行更為細緻的分類。比如在脂肪組織中得到的前體細胞應該命名為脂肪幹細胞，因為他們來自於脂肪組織且能夠分化為脂肪細胞。另外，目前已有的很多用於鑑定間充質幹細胞的細胞分子標誌並不可取。在人體的多種組織中都存在CD146陽性及CD45/31雙陰性的細胞，儘管它們有共同的分子標記且都具有很好的成克隆能力，但是轉錄組上的差異卻非常大。更為深入的研究發現，不同來源的這類細胞只能分化為本身特定的細胞類型，而不能夠分化為其他譜系的細胞。這也進一步證明，利用分子標記來鑑定細胞類群並不是萬無一失的。

目前的確也有少數的間充質幹細胞治療成功的臨床案例。比如，骨髓幹細胞移植用於治療大量的骨缺失和牙髓再生。然而在這兩個案例中，都沒有足夠的證據表明再生的組織來源於移植的幹細胞。因此在臨床應用之前，我們需要對間充質幹細胞進行更為深入的研究，尤其是對其中可能存在的幹細胞進行細緻的鑑定。

5

多能幹細胞介導的神經再生

成年人神經系統的再生能力較弱，且老年人體內的神經細胞退化嚴重，容易導致各種神經退行性疾病，比如帕金森、亨廷頓、視網膜退行性疾病、中風等。而胎兒的細胞具有較強的再生能力，因此移植胎兒細胞可以取代退化的神經元。儘管這一療法確有效果，但是細胞來源非常困難。

以帕金森病為例，患者中腦中的多巴胺能神經元逐步退化消失，進而引起多巴胺水平過低，患者行動障礙。目前主要的治療手段是使用多巴胺能藥物，提升多巴胺水平。該藥物早期對於患者有一定效果，但是長期使用會產生副作用，比如運動障礙和神經精神併發症。理論上，我們如果能夠重建患者大腦中的多巴胺能神經元，就可以有效治療帕金森病。因此在30年前便有人嘗試移植胎兒的中腦組織給病人，隨後在歐洲、美國及加拿大均有類似的臨床案例。比較這些實驗的結果發現，儘管療效因人而異，但是

6

總結

綜上所述，幹細胞療法的成功案例背後都有著數十年的深入的基礎研究作為鋪墊，其中包括幹細胞本身的生物學特性、分化譜系及信號傳導機制。同時，這些成功也需要切實可行的臨床治療方案。造血幹細胞移植只需要相對簡單的靜脈注射即可，表皮幹細胞則需要移植到皮膚合適的位置，而中樞神經系統相關的幹細胞治療操作更為複雜。除細胞移植之外，幹細胞療法還涉及到如何在移植之前清除患者體內已有的幹細胞，尤其是骨骼肌幹細胞。最後，我們如果能夠從成功案例中制定一套完善的評價標準，便可以將其推而廣之到其他的幹細胞及基因治療中，推動其發展。

原文鏈接：

閱讀更多 BioArt 的文章

關鍵字: 幹細胞 綜述 日本