克隆猴成功的秘訣有哪些呢？
中科院神經科學研究所的研究人員克服了克隆靈長類動物的挑戰。他們成功的關鍵即在於充分利用了最新的表觀遺傳學成果：
完成核移植之後，研究人員向卵細胞導入了表觀遺傳修飾的調節因子：KDM4D和TSA，以此來啟動胚胎髮育的功能基因。因為導入了表觀遺傳修飾因子，體細胞核中原本被抑制的基因重新被激活，並最終在代孕雌猴中獲得了很高比例的受孕率和正常發育率。
具體來說，在用TSA處理後又注入KDM4D mRNA的重構卵中，有44.7%發育成了囊胚。這些囊胚中又有64.7%形成內細胞團（Inner Cell Mass）。相比只使用TSA——囊胚獲得率為16.7%——有很大提高。由此看來，組蛋白去甲基化酶KDM4D顯著改善了SCNT的猴胚胎的表觀遺傳重編程，這一點與張毅教授組有關鼠和人的發現是相同的。
那麼，組蛋白甲基化修飾究竟作用於供體核的哪些基因？換句話說，哪些基因的失活在阻礙重編程的進程呢？為了找到答案，研究人員用RNA測序技術，發現了可能導致SCNT克隆胚胎髮育不良的基因，包括一些發育多能性相關基因如Dppa2，Dppa4和Myc，以及其他抑制基因如Zscan4和Polr3h。這些基因在胚胎髮育中發揮了什麼功能？如何通過操縱這些基因來促進SCNT胚胎的發育？這些謎底的揭開需要進一步的研究。
“中中”和“華華”的供體細胞核，來自同一只流產的猴胚胎的成纖維細胞，研究人員從中獲得了大量遺傳背景相同的細胞核。他們也嘗試了使用成年猴的體細胞核作為供體，但所得的克隆猴因呼吸異常，在出生後只存活了幾個小時。 由此看來，相比胚胎體細胞，成體體細胞的重編程的阻礙更大，但其具體機制還不明確。蒲慕明院士在發佈會中提到，如果成體體細胞作為供體的重構胚胎再多一些，也許是會成功的。
中科院神經科學研究所的研究人員指出，他們選用胚胎成纖維細胞作為供體的另一個原因，是便於在體外對其進行基因編輯和篩選，避開CRISPR-Cas9技術的脫靶問題和嵌合體現象，進而大量獲得遺傳背景相同的克隆動物。
研究負責人孫強介紹說，“我們嘗試了多種方法，但只有一種可行。成功得到克隆猴之前，我們經歷了多次失敗。” 論文第一作者劉真曾花了三年時間練習和優化SCNT技術（圖5）。為了快速準確地從卵細胞中去除細胞核，促進供體細胞核和去核卵細胞的融合，他測試了多種方法。
體細胞核移植技術中的顯微注射步驟（B,C,D,E,F）；重構細胞融合後正常發育為帶有內細胞團的囊胚
這些優化改進操作包括：用偏振光成像系統定位並去除卵細胞的遺傳物質；將核供體細胞與仙台病毒包膜（HVJ-E）一起溫育；使卵細胞透明帶形成激光損傷，以便於將供體細胞核注入卵周間隙（圖5D、E、F）。
中科院神經科學研究所所長、該研究的合作者蒲慕明院士指出，SCNT技術的實驗步驟非常精緻，你操作得越快，卵細胞受到的破壞就越少。劉真博士的手很巧，很能幹，但也付出了大量的實踐。並不是每個人都能準確迅速地完成去核和細胞融合的操作，核移植技術的優化是我們取得這一成功的關鍵（圖6）。
中國科學家使用體細胞核移植技術製備出克隆猴
目前，“中中”和“華華”還在喝奶（瓶喂）期，它們的生長髮育與同齡猴子相比無異。研究人員也會繼續關注“中中”和“華華”的身體發育和智力發展。預計未來幾個月會有更多的克隆獼猴誕生。研究人員也計劃繼續改進技術。
在慶祝克隆猴成功之餘，有待科學家解決的問題還有很多。比如，如何安全地獲取胎猴的體細胞？為何成體細胞核產生的克隆猴存活時間短？不同哺乳動物重構胚胎的重編程能力差異是由哪些因素決定的？不同哺乳動物的多能相關基因的表觀修飾有何差異？等等。
除此之外，人們最關心的，可能還是：
克隆猴技術所面對的倫理問題
這項動物研究工作嚴格遵循了美國國立衛生研究院制定的國際指南。至於在克隆非人類靈長類動物時，哪些做法可取，哪些做法不可取，孫強和蒲慕明鼓勵科學界就此展開討論。
蒲慕明院士強調，我們非常清楚這類準則的重要性，將來，無論在世界何處，如果使用非人靈長類動物進行實驗，都需要科學家嚴格遵循道德倫理標準。
在新聞發佈會上，也有多位記者就使用靈長類動物做實驗的倫理問題發問。對此，蒲慕明院士表示：
“克隆猴的目的是出於其對人類醫學價值的考量。現有的很多動物疾病模型與真實人類疾病表現有不同之處，猴子作為動物模型有其他動物無法比擬的優勢。而且，這項克隆猴技術使得短期內（約9個月）就能獲得遺傳背景完全相同的一代動物，實際上最終能夠減少動物的使用量。
幾年前基因編輯興起的時候，人們就其應用做過熱烈討論，出臺了嚴格的管理規則，現在實施得比較好，收到了不錯的效果。中國的動物實驗也會嚴格遵守國際標準。希望這項工作能使更多的人認識到克隆猴作為動物模型的優越性和重要性。”
不過，相信人們還是會禁不住發問：
“克隆猴會被人類溫柔以待嗎？”
“克隆猴已經降臨，克隆人還會遠嗎？”
……
對於這樣一個科技改變世界的時代，你是充滿期待還是……不寒而慄？ 不過這些都不重要，不妨看看視頻裡面可愛的小猴子，也許能改變您的看法？
1 劉真, 蔡毅君, 孫強. 非人靈長類基因修飾模型研究進展. 生物工程學報, 2017, 33(10): 1665-1673.
2 Matoba S et al.Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation.Cell. 2014, 6;159(4):884-95.
3 Chung YG et al.Histone Demethylase Expression Enhances Human Somatic Cell Nuclear Transfer Efficiency and Promotes Derivation of Pluripotent Stem Cells.Cell Stem Cell. 2015, 3;17(6):758-766.
4 Mummery CL, Roelen BA.Stem cells: Cloning human embryos.Nature. 2013,13;498(7453):174-5.
5 Loi P et al., A New, Dynamic Era for Somatic Cell Nuclear Transfer?Trends Biotechnol. 2016, 34(10):791-7.
6 Cell, Liu, Z. et al: "Cloning of macaque monkeys by somatic cell nuclear transfer"
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