鐵皮石斛組織培養一次成苗技術
鐵皮石斛種苗組織培養技術快速繁殖已初具規模，但一次成苗技術鮮有報道。組織培養一次成苗技術即是用一種培養基完成種苗的整個生長過程，極大簡化了組織培養流程。在鐵皮石斛組織培養研究中多以種子為外植體[3]，但是鮮有以莖段為外植體的一次成苗技術的報道，且可適於外植體培養的種子很少，很難滿足市場需求。本研究旨在簡化育苗流程，降低成本，促進鐵皮石斛的產業化發展。
1 材料和方法
1.1 材料
試驗所用的鐵皮石斛材料於2017 年5 月選自於江蘇省林科院。挑選健康、無病蟲害植株，以莖段作為外植體。
1.2 試驗方法
1.2.1 外植體的處理。選取長勢良好、均勻、葉片繁茂的鐵皮石斛材料，將其莖段從植株上剪下，去掉葉片後，剪取一定長度的帶節間莖段，將其放入搪瓷缸中，再將紗布蓋在搪瓷缸口，用流水沖洗20min。之後再將洗衣粉倒在搪瓷缸裡，用玻璃棒攪拌均勻，浸泡30min。用流水沖洗乾淨後，將材料用75%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗1 次，再用0.1%的昇汞浸泡8min，用無菌水衝洗5~8 次，材料滅菌後應立即取出，然後放在無菌紙上瀝乾，留待接種。
1.2.2 一次成苗初代培養基的篩選。基本培養基使用MS 和1/2MS，分別添加0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L 的NAA 與1mg/L、3mg/L、5mg/L 的6- BA，在此基礎上添加香蕉泥100g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5g/L，pH 值為 5.8。將消毒好的鐵皮石斛莖段接種在上述不同處理的培養基中，每種處理接種外植體10 瓶，每瓶接種5 個莖段材料。將所有的組培苗放在光照強度為2000Lx，溫度為（25±2）℃的培養室裡，35d 後統計不定芽的誘導率。不定芽的誘導率（%）= 誘導出芽苗數/ 未汙染的接種數，統計並作好記錄，從而篩選出一次成苗的最適培養基。
表1 不同的培養基對成苗的影響
2 結果
試驗結果表明，基本培養基為1/2MS 的鐵皮石斛組培苗不定芽的誘導率普遍比基本培養基為MS 的不定芽誘導率高，且長勢普遍良好，比基本培養基為MS的組培苗效果更加明顯，誘導的不定芽更多，更加壯實。在接種莖段後的5~15d 內，不同處理的鐵皮石斛組培苗都開始發芽，但是隨著時間的推移，在生長後期開始出現明顯差距，有的不定芽生長不明顯，有的不定芽生長慢，非常細弱。基本培養基為1/2MS 的鐵皮石斛組培苗明顯長勢普遍更佳，組培苗的不定芽數更多，不定芽長得更加健壯。
培養基中不同濃度的激素含量對組培苗的不定芽
的生長誘導及促進有一定程度的差異。在植物組織培養中最常用的是生長素和細胞分裂素，本實驗選用了其中最具代表性的NAA和6- BA 來進行研究。當培養基中的激素NAA 濃度在0.5mg/L 時，鐵皮石斛組培苗不定芽生長的數量及其誘導率相比，NAA濃度為0.3mg/L 以及0.7mg/L 時更多更高，而且較其而言，當培養基中的NAA 為0.5mg/L 時其組培苗長勢更佳，不定芽長得更加壯實、健康、旺盛。但當NAA 在0.3mg/L 以及0.7mg/L 時，不定芽的誘導率相比較而言較低，對組培苗不定芽的生長，不定芽的誘導有一定程度的抑制作用；當培養基中的6- BA 為3mg/L 時，鐵皮石斛組培苗的不定芽的誘導率比較高，不定芽生長的數量及其誘導率相比6- BA 濃度為1mg/L 以及5mg/L
時更多更高，且培養基中的6- BA 為3mg/L 的石斛組培苗長勢相較更佳，當培養基中的6- BA 濃度為1mg/L及5mg/L 時，對鐵皮石斛組培苗的不定芽的誘導與生長起到一定程度的抑制作用，長勢也相較略差，不定芽長得比較緩慢，瘦弱。數據表明：隨著培養基中的激素NAA濃度的提高，激素6- BA 對不定芽誘導與生長的影響呈現著先增大後減小的趨勢，這說明過高或過低濃度的6- BA 對不定芽的增殖有著一定程度的抑制作用。從整體來看，培養基中的激素NAA 對鐵皮石斛組培苗不定芽誘導與生長的影響隨著其濃度的增高而逐漸開始抑制。由此可見：選取合適的培養基激素濃度對組培苗不定芽的增殖有顯著的促進作用。總的數據統計表明：培養基中的NAA 濃度在
0.5mg/L 以及其中的激素6- BA 濃度為3mg/L 時，鐵皮石斛的組培苗不定芽的誘導與生長情況為最佳狀態，這2種濃度的激素都極利於不定芽的生長。在培養基中加入的激素NAA 濃度為0.3mg/L、0.7mg/L 以及培養基中的激素6- BA 濃度為1mg/L、5mg/L 時，組培苗的不定芽誘導率都相較較低而且不定芽的數量也很少，生長明顯緩慢，生長後期幾乎停止生長，且不定芽長得十分瘦弱，長勢不佳。因此，由此可得出鐵皮石斛一次成苗的最適培養基配方為：1/2MS+ 蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L+ 香蕉泥100g/L+NAA 0.5mg/L+ 6- BA3mg/L，pH 值為5.8，這一培養基最利於鐵皮石斛組培苗不定芽的誘導與生長。3 討論
石斛一直被認為是中藥中的上品，已在臨床上及
中藥複方中被廣泛應用。況且，鐵皮石斛的花朵外形優美，花香怡人，廣受人們的喜愛並具有極高的觀賞價值，在國際花卉市場上佔有重要的地位。但是由於人們對鐵皮石斛的過度開採，它的的野生生態壞境遭到嚴重破壞，野生資源正在大幅度減少，已瀕臨絕跡，但是與此同時，它的市場的需求量在逐年上升，鐵皮石斛材料短缺，作為瀕臨滅絕的受保護中藥品種之一[4]，市場售價較高。鐵皮石斛人工培養具有重大意義，現關於鐵皮石斛快繁體系研究頗多並有顯著成果，在市場上多已利用於規模生產，但在其組織培養繁殖[5]方面仍存在問題，並且關於以其莖段為外植體的一次成苗技術鮮有報道，其系統性也不夠，本研究主要在前人研究的 基礎上，課題組成員多方查閱文獻資料，廣泛進行調查研究，對國內外本項目領域的研究現狀進行分析，對鐵皮石斛一次成苗過程進行初步研究，以期能夠簡化鐵皮石斛組培種苗培育的流程，將其投入大規模的工廠生產可大大降低成本，縮短種苗的繁育時間，以期推動鐵皮石斛的產業化進程
閱讀更多 青錢柳 的文章
