期刊：Nature Communications
影響因子：12.124
作者單位：復旦大學上海醫學院
發表時間：2016年4月6日
01
摘要
環狀RNAs（circRNAs）代表一類廣泛而多樣的內源性RNAs，可調控真核生物中的基因表達。然而，人類circRNAs的調節和功能仍然大部分未知。本研究從六個正常組織和七種癌症的去核糖體RNA測序中檢測到至少27000個候選的circRNAs。許多這些circRNAs在正常和癌組織之間差異表達。作者進一步表徵了來自HIPK3基因的外顯子2的一個豐富的circRNA，稱為circHIPK3。circHIPK3沉默（而不是HIPK3 mRNA）顯著抑制人類細胞生長。通過熒光素酶篩選試驗，觀察到circHIPK3具有18個潛在結合位點作為9個miRNAs海綿。具體而言，研究顯示circHIPK3直接結合miR-124並抑制miR-124活性。研究結果提供證據表明從前體mRNA產生的環狀RNA可能在人類細胞中具有調節作用。
02
研究背景
來自反向剪接外顯子的環狀RNAs（circRNAs）最近被鑑定為天然存在的非編碼RNA家族，其在真核轉錄組中高度存在。已經在各種細胞系和不同物種中成功鑑定了大量的circRNAs。最近，已經證明circRNA作為microRNA（miRNA）海綿來調節基因表達。具體而言，含有70多個常規miR-7結合位點的circRNA ciRS-7（也稱為CDR1as）已經被鑑定為miRNA抑制劑。然而，只有少數這樣的circRNA包含多個結合位點來捕獲一個特定的miRNA，並且circRNA的功能仍然大部分是未知的。
03
研究路線
1、 circHIPK3篩選及鑑定：circRNA高通量測序、生物信息分析、qRT-PCR、Northern blot 、RNA FISH等
2、 circHIPK3生物合成機制鑑定：表達載體(含有不同側翼的Alu序列的截短體)、CRISPR/Cas9
3、 circHIPK3功能研究：qRT–PCR、RNAi、CCK-8檢測、EdU等
4、 機制研究：RIP、熒光素酶報告基因、miRNA mimics、ClIP、qRT–PCR、RNA熒光原位雜交
04
研究結果
circHIPK3篩選及驗證
圖1
作者通過去核糖體RNA高通量測序共鑑定出27296個環狀RNA分子，circRNA在不同組織中的表達模式非常特異（圖1a）。生物信息分析顯示單個蛋白基因可以產生多個circRNAs，但同一基因起源的circRNA也存在優勢表達的circRNA。CircHIPK3由HIPK3基因的2號外顯子形成，相比於HIPK3基因產生的其他circRNAs分子表達丰度最高，qPCR檢測和測序結果證實circHIPK3的存在（圖1b）。FISH顯示circHIPK3主要存在細胞質（圖1c）。
circHIPK3功能研究
圖2
作者通過將2號外顯子和側翼Alu序列分段構建表達載體以及採用CRISPR/Cas9技術，發現circHIPK3成環表達需要兩翼Alu序列協助，不可或缺（圖2a,2b）。使用siRNA敲降circHIPK3後發現顯著抑制腫瘤細胞的增殖能力，EdU實驗得到同樣的結論（圖2c,2d）。而敲降線性HIPK3則無作用。
機制研究
圖3
作者藉助公共數據分析發現在circHIPK3基因組位置存在許多AGO2結合位點，暗示miRNA可能結合circHIPK3，進一步預測發現circHIPK3序列存在多種miRNA結合位點。通過miRNA靶基因熒光素酶報告基因篩選系統，鑑定9個miRNA對熒光素酶活性有顯著抑制效果（圖3a）。其中miR-124的抑制效果最為明顯（圖3b）。共定位實驗表明，circHIPK3與miR-124相互結合（圖3c）。異位表達的circHIPK3能緩解miR-124抑制增殖的作用。在人的6個正常組織中檢測circHIPK3和miR-124的表達，發現在腦中表達最高，表達譜模式正相關，進一步表明circHIPK3和miR-124結合來調控細胞生長（圖3d）。
05
結論
圖4
1、 鑑定出人類六種正常組織和七種腫瘤組織中近三萬種環狀RNA及特徵；
2、 鑑定高表達的外顯子樣環狀RNA circHIPK3；
3、 含有多個重複序列的長內含子對circHIPK3生物合成具有重要作用 ；
4、 環狀RNA circHIPK3與包括miR-124的9種miRNA結合起調控作用。
本研究中所用siRNA、EdU、miRNA mimics均由銳博生物提供。
原文：Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature communications, 2016, 7.
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