因為單顆粒冷凍電鏡厚積薄發的技術突破，結構生物學在2013年底經歷了一場“分辨率革命 (resolution revolution) ”，從此幾家歡喜幾家愁。歡喜的是，之前許多讓科學家們束手無策的生物大分子們紛紛被揭開了神秘面紗；愁的是，作為研究者，為伊消得人憔悴、驀然回首卻在燈火闌珊處的樂趣少了許多。
但是科研永無止境。過去十幾年，每當有人問我結構生物學的未來，我的答案從未改變：“實時觀察細胞內部近原子分辨率的結構”。目前還沒有技術可以達到這一時空分辨率，而最接近的就是cryo-ET (冷凍電鏡斷層成像)。可以預見，這個技術的不斷髮展終將帶來另一場分辨率革命，其意義輻射生命科學許多分支。
Cryo-ET仍舊處於蓬勃發展的階段，在我赴普林斯頓任教前的幾個月，成功幫清華引進了年輕的Cryo-ET專家李賽博士。過去三年，我也一直在努力幫普林斯頓大學招聘cryo-ET方面的人才，現在卻依然是進行時，因為這個領域的人才確實是鳳毛麟角。《返樸》邀請李賽博士撰稿，簡要介紹cryo-ET的原理和發展，以饗讀者。
——顏寧
撰文 | 李賽（清華大學結構生物學高精尖創新中心研究員）、徐家璐（李賽實驗室博士研究生）
病毒，是直徑100 nm左右的超大分子複合物。它的尺寸恰好在電子顯微鏡的透射範圍內，為了探明病毒的結構，需要不斷優化電子顯微鏡的功能和電鏡數據的處理方法。可以說，現代冷凍電鏡方法學是與結構病毒學手牽手一起發展的。
冷凍電子顯微鏡——“眼見為實”的魅力
無論是列文虎克等科學家通過光學顯微鏡將細胞的結構展現在世人的面前，還是沃森和克里克發現DNA雙螺旋結構，揭示基因遺傳的分子機制，都向我們證明了科學研究中“眼見為實”的魅力。生命科學所研究的大多數情境，都發生在極為微小的細胞中。一個細胞的尺度可能比一根頭髮絲的十分之一還小，更別說組成細胞的蛋白質、脂質、核酸等等。因此，想要看清楚蛋白質等分子的結構，依靠傳統的光學顯微鏡是無法做到的。
隨著20世紀物理學的不斷髮展，科學家發現電子也是一種波。當電子束照射到某一個物體上時，電子會像光子一樣攜帶物體的形狀信息，並繼續向前傳播。又由於電子在磁場下會發生偏轉，所以我們可以用磁場做出像放大鏡一樣的透鏡系統。有了這兩方面的理論準備，電子顯微鏡應運而生。由於電子的波長遠小於光子的波長，電子顯微鏡的理論分辨率極限也遠超光學顯微鏡的分辨率。在材料領域中，電子顯微鏡甚至可以觀測到原子之間的排布。
儘管電子顯微鏡的放大能力無比強大，但並不是只要將細胞放在顯微鏡下就能看清楚裡面的細節。由於電子很容易受空氣中的灰塵或者空氣分子本身的影響，電子顯微鏡的內腔需要維持在近真空下。而在真空中，細胞裡面的水分子會瞬間沸騰氣化（液體的沸點會隨著氣壓的下降而下降），細胞也將隨之煙消雲散。所以，我們需要首先將細胞或者其他生物樣本在極低的溫度下瞬間冷凍，鎖住它們在那一刻的狀態，然後才能在冷凍電鏡下進行觀察。這也是冷凍電子顯微鏡成像（cryo-electron microscopy，簡稱cryo-EM）中“冷凍”（cryo-）兩個字的由來。
除了需要冷凍以外，生物樣品在冷凍電鏡領域的應用還受到另外一個重要限制，那就是樣品並不能經受過多的電子輻照。過多的電子輻照會破壞蛋白結構，給冷凍狀態下的樣品造成局部受熱並引發膨脹，甚至可能會融化玻璃態的冰。因此，我們用冷凍電鏡觀測生物樣品時，只能使用較低的電子劑量。但這就好比在漆黑的夜晚，不使用閃光燈就給人拍照，獲得的照片將是模糊的。與之類似，使用冷凍電鏡對生物樣品進行單次拍照，信噪比也非常低。當然，科學家也有應對之道：首先純化我們感興趣的蛋白質，然後把溶解了成千上萬個蛋白質分子的溶液極速冷凍後放在電鏡裡拍照。這時就可以獲得幾十萬顆這種蛋白質的照片，並且每個蛋白質的方向各不相同，相當於對同一個蛋白質拍了幾十萬張不同的投影照片。將這些照片的信號疊加在一起，我們就能夠提高信噪比，獲得這個蛋白質的高清三維結構。這種方法也就是冷凍電鏡單顆粒成像技術SPA（Single particle analysis）。
圖1. 使用冷凍電鏡解析的正二十面體型病毒的結構比較[1]。
斷層成像：與其他結構生物學手段互補
隨著直接探測電子相機（DDD camera）的出現和新算法的開發，冷凍電鏡在2013年迎來一場分辨率革命（resolution revolusion），並逐漸成為結構生物學的主要研究方法。七年過去了，冷凍電鏡單顆粒技術解析的高分辨率蛋白質結構如雨後春筍般顯現，極大地豐富了人們對蛋白質微觀結構與功能的認知。
與日漸成熟的冷凍電鏡單顆粒技術一道，冷凍電鏡斷層成像技術cryo-ET（cryo-electron tomography）和子斷層圖像平均法STA（sub-tomogram average）也正在悄然崛起，將結構生物學引導向解析柔性超大分子複合物結構、細胞原位蛋白結構等方向，應用範圍覆蓋蛋白複合物、病毒、細菌、細胞甚至組織，分辨率最高已達3Å [2]，是名副其實的跨尺度高分辨顯微成像利器。
cryo-ET被應用在結構生物學中，可以回答很多獨一無二的生物學問題，在筆者看來最吸引人的有四個：1）它帶來豐富的、納米級分辨率的生物背景 (context) 。比如生物大分子在原生環境中的拷貝數、分佈規律、與其他分子的互作；2）它展示天然原位的生物結構；3）它的三維原始數據特點為解析柔性超大分子複合物帶來可能；4）結合光電聯合、聚焦離子束減薄等技術，它可以實現跨尺度高分辨成像，甚至可以從生物組織中獲得納米級分辨率三維信息。
實際上，目前結構生物學領域積攢了太多隻有cryo-ET才能回答的問題。由於應用前景廣闊，可拓展空間巨大，cryo-ET被譽為結構生物學的未來技術方向。 圖2. cryo-ET是一種高分辨、跨尺度的原位顯微成像方法，應用面非常廣闊（圖：李賽）
那麼cryo-ET的原理是什麼呢？
首先，cryo-ET的“T”和在醫院裡做的CT（computerized tomography，意為“電子計算機斷層掃描”）的“T”是同一事物，都是“斷層”的意思，二者的三維成像原理也很類似。在醫院做CT檢查，掃描儀器會繞著身體旋轉並進行拍攝。而對於cryo-ET來說，需要旋轉樣品而不是電鏡。通過旋轉樣品臺，我們可以對樣品進行不同角度的拍攝，一般是在-60°到+60°的範圍內。
圖3. CT、ET、EM的比較（圖片來自Joachim Frank書籍） 從-60°到正60°，每隔3°對樣品拍一張照，共可得到41張平面照片。這41 張照片足以構建樣品的三維信息嗎？從二維投影到三維圖像的重構原理是什麼？分辨率的限制是什麼？這些關於cryo-ET的基礎的思考誘發了幾個重要理論的建立，它們奠定了cryo-ET技術的理論基礎，是後人細化技術革新的理論堅石。
01 中心截面定理
中心截面定理是指，一個物體在某一方向上投影的傅里葉變換，等於該物體三維傅里葉變換中過中心的與投影方向垂直的截面。
根據中心截面定理，我們拍攝41張不同角度的照片，對這些照片做傅里葉變換，就能夠得到這個物體三維傅里葉空間裡41張截面的信息。我們再對這個被信息填充的三維傅里葉空間做逆變換，就能夠獲得該圖像的三維形狀。因而，我們可以通過cryo-ET技術獲得細胞或者蛋白質的三維結構。
圖4. 中心截面定理的示意圖，三維的兔子被投影成二維照片後做傅里葉變換，與三維兔子直接做傅里葉變換後垂直投影方向的截面是一樣的。（圖片來自於牛津大學cryo-ET workshop課件）
圖5. cryo-ET成像示意圖。（a）FEG表示電子槍，用於發射電子。CCD camera相機用於採集照片。光路下的樣品被一邊旋轉一邊拍攝；（b）表示對同一個物體進行了不同角度的拍攝；（c）代表通過這些不同角度的照片重構出物體原本的結構（Gruenewald et al., 1993）。
02 克勞瑟準則
細心的讀者朋友也許發現了，41張照片遠遠不足以填充連續的三維傅里葉空間，只能夠離散地對其做出不完整的填充。並且由於低電子劑量拍照的原因，每一個角度的照片都有著很高的噪音。其實，在cryo-ET技術發展的早期，科學家們已經對cryo-ET成像的潛力進行了物理與數學上的分析。劍橋分子生物學實驗室（MRC-LMB）的結構病毒學家Tony Crowther等人在1969年分析了對於一定尺寸的物體，至少需要多少不同角度照片才能將其結構重構到一定分辨率，並提出了一項準則：克勞瑟準則 Crowther criterion [3]。
克勞瑟準則的公示表達是：N=πD/d。其中，D和d分別代表了樣品的尺寸以及想要達到的分辨率，N是想要獲得目標分辨率至少需要拍攝的傾轉照片數量。例如，當樣品是直徑100nm的病毒，而我們想要獲得的分辨率是10nm的話，那麼我們所需要拍攝的不同角度數大約是31張。當然，克勞瑟準則的推導需要很多前提條件，但它提出的概念仍具有極強的指導意義：即使電鏡拍攝的不同角度照片數量有限，我們仍可以獲得納米分辨率級別的三維結構信息。 這表明冷凍電鏡斷層成像這一技術是具有研發和應用的前景的。
03 電子劑量分配定理
1976年，位於德國慕尼黑附近的馬克斯普朗克生物化學所的Walter Hoppe (2017年諾獎得主Joachim Frank的博士導師) 又提出了關於電子劑量分配的定理Dose fractionation theorem[4]：假設使用同樣的電子劑量拍照，把這些劑量平均分配給多個角度的照片（假設可以完美地對齊這些照片），那麼相比於用該劑量一次性給單個角度拍照，從這些傾轉照片獲得的三維信息將更好。
簡單說來，這意味著儘管cryo-ET的每個單張照片可能信噪比較低，但重構成三維圖像後，信號可以加強，並且理論上信號質量可以超過單次高劑量投影相片。
圖6. 按照解決生物問題的不同，ET技術方向有多種層次的細分（圖：李賽） 有了這些理論上可行性的分析和鋪墊，cryo-ET技術在後來40多年的發展中被應用到蛋白複合物、病毒、細菌、細胞甚至組織等跨尺度高分辨成像中，在技術上不斷細分並不斷完善。
STA：原子級別的分辨率
瞭解單顆粒技術（SPA）的讀者朋友也許會疑問，在使用單顆粒技術解析蛋白質結構時，往往需要對幾十萬顆同種蛋白質進行拍攝，才能夠填補傅里葉空間，獲得高分辨率的結構。那麼cryo-ET中有類似的方法嗎？答案是肯定的。
在cryo-ET收集的數據中，可能也會出現高度重複的同一種蛋白或者更大的複合體。例如新冠病毒原位全病毒結構[5]，每套cryo-ET數據都包含了10多顆完整的新冠病毒，平均每顆新冠病毒的表面分佈著30個刺突蛋白。既然這些刺突蛋白是同一種蛋白質，並且大量重複出現，就可以將其所在的子斷層圖像（sub-tomogram）裁剪出來，並旋轉到同一個方向，把所有的該蛋白質的信號疊加起來，這樣就可以獲得一個高信號、低噪音的蛋白質結構，這也就是STA的原理。
圖7. 子斷層平均法的示意圖。Cryo-ET獲得的斷層成像中，相同蛋白所在的子斷層被裁剪出來，並對齊到同一方向。這時，將所有子斷層的信號進行疊加就能獲得高信噪比的三維重構[6]。
由於刺突蛋白在原始三維數據中的準確座標已經確定，因此在解出蛋白結構後，可以將其投射回去。通過這種方法，研究者從2300顆新冠病毒的cryo-ET數據中計算出最高達7.8Å分辨率的刺突結構，以及13Å的核糖核蛋白複合物（RNP）結構，並投射重構出一個具有代表性的新冠病毒全病毒結構。
圖8. 新冠病毒斷層圖像截面，疊加在原始數據上的使用STA重構的完整病毒結構，以及刺突蛋白最高達7.8Å分辨率的結構[5]
讀到這裡，讀者朋友們可能會感覺：子斷層平均法STA與單顆粒技術SPA的原理很像，都是將同一種蛋白質的信號大量疊加在一起來提升信噪比，事實上也確實如此。當然，子斷層平均法目前的分辨率還比不過單顆粒技術，原因有很多，可能是拍照效率不夠高、拍照過程中樣品抖動、生物樣品受到電子輻照損傷等等。
單顆粒技術每次只需要拍一張照片，這個過程可能只需要半分鐘，而使用斷層成像時，則要傾轉樣品，又要保持傾轉的過程中樣品不被挪出拍照視野，所以一套cryo-ET的數據採集相對費時，大約需要半小時。這樣一來，使用cryo-ET方法很難獲得像單顆粒方法一樣多的數據。數量上不去，最終的分辨率自然受到限制。
另外，電鏡的機械裝置在傾轉樣品時，難免會導致樣品的前後位置對應不起來。這就好比在拍CT時，儘管醫生交代了需要保持靜止，患者卻左右晃動。這會造成最終重構出的結構像拍攝奔跑的運動員一樣帶著糊影。最後，過多電子的照射會使生物樣品所在的冰層發生形變，這和樣品的抖動一樣，也會造成分辨率的下降。
以上這些限制cryo-ET分辨率的因素，造成了目前大多數cryo-ET和STA應用所獲得的分辨率一直停留在4Å以外。在2015年，被廣泛使用的單顆粒重構軟件Relion的研究團隊在Structure雜誌上發文，把Relion的算法應用到了STA上[7]。作者在論文中明確指出，電子輻照產生的樣品移動是限制STA分辨率的重要因素。具體來說，不同角度之間的樣品移動只能通過金顆粒進行校正，其準確性是不足的。
但科學家們一直在不斷努力打破分辨率的極限。2018年，牛津大學章佩君團隊開發了emClarity軟件，首次實現了以樣品顆粒為基準來校準不同角度之間樣品的移動，並通過循環來實現校準，獲得了3.1Å的核糖體（體外提純樣品）STA結構[8]。
今年，位於德國哥廷根的馬克斯普朗克生物物理化學研究所Patrick Cramer團隊的Dimitry Tegunov等人開發了M軟件[10]。結合使用M及他們之前開發的Wrap軟件[9]，能對電子產生的樣品移動及冰層形變進行更為精確的校準。這一算法成功地將細胞切片的cryo-ET數據中的核糖體解析到了3.7Å的分辨率，並清晰地展示了其中的抗生素電子密度。這一令人震驚的結果預示著cryo-ET和STA的高分辨時代也許即將到來。在不久的將來，也許我們可以將原位的蛋白結構廣泛地解析到近原子分辨率，使用cryo-ET來獲得蛋白質的原子模型將成為可能。而在這背後作為支撐的，則是越來越穩定高效的電鏡硬件，性能越來越高的計算機，以及考慮越來越精細的算法。
囊膜病毒的“照妖鏡”
在冷凍電鏡結構病毒學的發展過程中，加州大學聖地亞哥分校的Timothy Baker和牛津粒子成像中心的首屆主任Stephen Fuller起著奠基者的作用。Baker堅持研究以正二十面體型為主的無囊膜病毒 (nonenveloped virus)，而Fuller則選擇了對人類健康威脅更大的囊膜病毒 (enveloped virus)。無囊膜病毒沒有囊膜，直接由蛋白質外殼包裹，其範疇較廣，從動物病毒、噬菌體、到水生病毒等都有。囊膜病毒的外圍則有脂質雙層膜包裹，侵擾人類的天花、乙肝、艾滋、狂犬、流感、寨卡等病毒，均是囊膜病毒。
雖然都是病毒，但針對兩者的研究手段有很大的區別。無囊膜病毒大多數就像一個模子刻出來的，典型的結構是正二十面體組裝（圖1），其結構解析主要使用冷凍電鏡成像技術cryo-EM及單顆粒重構方法SPA。而絕大多數囊膜病毒組裝鬆散，柔性極大，高分辨率重構整顆囊膜病毒的唯一方法，就是採用冷凍電鏡斷層成像技術cryo-ET和子斷層圖像平均法STA。 為了解析囊膜病毒結構，Fuller從此邁入cryo-ET這個在當時異常年輕的領域。
圖9. 使用冷凍電鏡斷層成像和子斷層圖像平均法解析的囊膜病毒比較。自左至右：新冠病毒、裂谷熱病毒、漢坦病毒、拉沙病毒、流感病毒、鹽生多形型病毒（來源：李賽實驗室及李賽項目圖片）
2000年，Fuller辭去海德堡歐洲分子生物學實驗室（EMBL Heidelberg）主任一職，搬到有多年結構病毒學傳統的牛津大學結構生物學部，並在那裡與學部主任David Stuart（饒子和院士的博士後導師）聯手建立了牛津粒子成像中心，並任第一屆主任。他主持建成了集成高端冷凍電鏡設施的BSL-3（生物安全三級）實驗室，並在那裡開展艾滋病毒HIV的成像及結構工作。至今，全世界同一級別、功能類似的實驗室僅有兩家，另一家在美國德克薩斯大學醫學院 (UTMB)，主要從事病原微生物的鑑定、病原-宿主相互作用及結構解析等方面的研究。
肆虐全球的新冠病毒（SARS-CoV-2）亦屬於囊膜病毒。2020年，在新冠病毒基因序列公佈之後的3個月內，重組表達的刺突蛋白、核蛋白的局部結構已經被解析出來了。然而，病毒的完整結構、結構蛋白在病毒上的原位全長結構、分佈規律、拷貝數及與其他結構蛋白的互相關係仍是謎團。
如果能儘快將病毒的形象真實、完整、清晰地呈現給世界，也許就能讓更多人對病毒有直觀認識，對疫情防治重視起來。今年八九月間，Nature
[11]、Science [12]、Cell [5]雜誌分別報道了英國劍橋、德國馬普所、清華大學的研究人員解析新冠病毒原位結構的研究。眾多網友紛紛評論：“病毒長得很瘮人”“毛骨悚然”“一看就不好惹”“為新冠病毒張貼了高清的通緝照”……可見完整真實的病毒形象的確帶來了視覺衝擊，起到了警示作用。
圖10. 真實的新冠病毒全病毒結構
[5]。冠狀病毒的“皇冠”特徵，來源於病毒表面凸起的刺突蛋白（spike protein）。它就像一把“鑰匙”，讓新冠病毒識別出細胞表面的受體，並與之結合，介導膜融合，最終侵入細胞。目前大多數疫苗和抗體的研發都聚焦於刺突蛋白。在全病毒結構解析的過程中，研究人員發現，相比於其他囊膜病毒，新冠病毒的刺突蛋白有三個獨特的地方：
（1）在病毒表面分佈隨機，且拷貝數較少（平均約30個），僅為拉沙病毒及流感病毒的1/5-1/10；
（2）靠近病毒囊膜的莖部區柔性較大，使得刺突蛋白在病毒表面能夠近乎自由地旋轉，甚至可能遊走，就像古代的武器“鏈錘”一樣。因此新冠病毒在侵染細胞時，能夠自由調整刺突蛋白的方位，方便和單個、甚至多個受體結合，這可能是新冠病毒高傳染性的原因之一；
（3）刺突蛋白在病毒表面可呈現兩種狀態：其中97%處於“融合前狀態”（prefusion），3%處於“融合後狀態”（postfusion），只有後者才能和ACE2受體結合。一般而言，刺突蛋白只有受到pH值變化、受體結合等因子觸發才會向融合後狀態轉變，而新冠病毒帶有疑似“自發”的融合後狀態。這種狀態的刺突蛋白已經缺失了其S1亞基，剩下的S2亞基已經發生較大的形變，也許能“欺騙性”地誘導出一些抗體，但這種抗體可能無法中和正常的病毒。
除了解析病毒表面的刺突蛋白結構，清華大學的研究人員還在仔細查看新冠病毒的斷層圖像過程中，發現病毒體內塞滿了空心珠子一樣的東西，而且這些珠子似乎有著排列規則。在貼近病毒囊膜上下表面的地方，有時可以看見這些珠子排列成清晰的六邊形。經驗表明，這些珠子可能就是核糖核蛋白複合物RNP，而且它們是有多個層次結構的。
圖11. 新冠病毒體內有很多珠子一樣的物質，而且它們隱約有排列規律。標尺為50納米（圖：李賽）
經過挑選和分析，研究人員展示出，新冠病毒腔內的RNP像串珠一樣將RNA組織在一起，並在病毒體內呈現六聚“鳥巢”型和正四面體“金字塔”型兩種局部排列，有序地收納了長長的RNA鏈條，還增加了病毒在複雜環境中經受物理挑戰的能力。這可能是世界範圍內首次“看清”正義單鏈RNA病毒的內部結構。
以上三篇解析新冠病毒全病毒結構的文章實際都得益於Stephen Fuller早年種下的大樹。Nature一文的通訊作者John Briggs是Fuller的博士生；Science一文的第一作者Beata Turnova是John Briggs的博士生；Cell一文的通訊作者李賽在牛津粒子成像中心做了5年博後/副研，可算是Fuller的第三代弟子。令人痛惜的是，Fuller因健康原因56歲便退休，60歲時便英年早逝（2014年）了。他雖未能親眼目睹冷凍電鏡在後來突飛猛進的技術革命，但他創始的囊膜病毒結構學及參與奠基的cryo-ET技術現在已是遍地開花。願以此文紀念Fuller教授。
圖12.（左）牛津大學粒子成像中心創始人之一Stephen Fuller教授及其團隊的自畫像；（右）該中心BSL-3級冷凍電鏡實驗室內景。（來源：李賽）
參考文獻
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[11] Z.Ke et al., Structures and distributionsof SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature 10.1038/s41586-020-2665-2 (2020).
[12] B.Turonova et al., In situ structuralanalysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science 10.1126/science.abd5223 (2020).
作者介紹
李賽從事冷凍電鏡斷層成像技術開發及囊膜病毒的結構研究。2009-2012年，他在德國哥廷根大學物理學院從事流感病毒組裝機制研究，並獲得博士學位；2012-2018年，在牛津大學結構生物學部的BSL-3級實驗室開發及使用cryo-ET方法，並研究了拉沙病毒、裂谷熱病毒、漢坦病毒及嗜鹽古菌多形病毒的高分辨結構；2018年入職清華大學生命學院並建立獨立實驗室，開展了冠狀病毒、艾滋病毒等研究。在過去12年的囊膜病毒研究中，他較為系統地研究了新發致病型囊膜病毒的組裝，及通過膜融合去組裝的原位結構與機制，並希望找到病毒的弱點。為解答這些問題，他一直深耕於高分辨率 cryo-ET方法的開發及應用。他的工作發表在Cell、Cell Research、Nature Communications、Cell Reports、PLoS Pathogens等刊物上。
