本文作者：汪楠，劉靜，張俊（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 腫瘤科，上海 200025）
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【摘要】 隨著精準醫學時代的來臨，腫瘤樣本的分子表達譜已成為判斷預後、制訂個體化治療策略、監測腫瘤復發和耐藥的重要依據。相較於組織活檢，液體活檢技術因其無創性、安全性、全面性和實時動態性等特點，在分子檢測領域得到越來越廣泛的關注和應用。本文圍繞液體活檢技術在結直腸癌中的研究進展做一綜述，其中包括與組織活檢的一致性、早期篩查、監測復發、個體化用藥指導和耐藥性監測等，並對其侷限性和未來發展方向加以展望。
【關鍵詞】 結直腸癌；液體活檢；復發；繼發性耐藥
《2018年全球癌症統計報告》顯示，結直腸癌的發病率和死亡率位列所有腫瘤的第3位和第2位[1]，
嚴重威脅公眾健康。雖然早期結直腸癌患者術後5年生存率高達80%～90%，但伴遠處轉移的結直腸癌患者生存仍不樂觀，5年生存率約為14%[2]。結直腸癌高死亡率的主要原因在於其早期篩查困難，晚期治療手段有限，且缺乏有效的療效評估和耐藥監測手段。
隨著精準醫學時代的來臨，腫瘤樣本的分子表達譜已成為判斷預後、指導個體化用藥和監測耐藥性的重要手段。但傳統的腫瘤組織活檢仍具有一定侷限性：部分患者標本獲取困難；腫瘤時空和空間異質性導致單次活檢無法獲取基因譜的全貌及動態監測疾病變化；活檢的有創性和風險限制了多次獲取標本的可行性。腫瘤組織活檢的替代方法——液體活檢技術是指從以血漿為代表的體液樣本中分離和分析腫瘤衍生物質，包括循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環RNA和外泌體（exosomes）等，因其具有無創性、安全性、全面性和實時動態性等特點而越來越受到關注。本文就近年來液體活檢技術在結直腸癌中的研究進展做一綜述。
1 液體活檢與組織活檢的一致性
雖然液體活檢技術以其獨特的優勢迅速發展，但其臨床應用仍存在爭議和質疑，主要原因是液體活檢與組織活檢的一致性尚未得到完全肯定。Razavi等[3]使用超深度測序發現超過50%的ctDNA突變是假陽性，且與組織突變的一致性不足1/4，另有研究指出不同機構液體活檢所得到的結果一致性較低[4]。原因包括樣本量較小不具代表性，組織活檢與液體活檢採樣時間不同，治療期間誘導克隆性造血相關突變增多進而干擾ctDNA檢測等。
近年來，越來越多的大規模研究結果相繼證實，液體活檢和組織活檢的一致性可達80%～90%，尤其是對治療有意義的驅動基因變異[5-7]。Schmiegel等[8]研究證實了結直腸癌血漿ctDNA檢測RAS突變和組織活檢結果一致性達91.8%。Normanno等[9]對340例接受西妥昔單抗聯合FOLFIRI方案[（伊立替康＋5-氟尿嘧啶（5-FU）＋亞葉酸鈣]治療的轉移性結直腸癌患者進行檢測，發現腫瘤組織與液體活檢的RAS基因狀態和中位無進展生存時間結果相當，一致率為78.3%，表明液體活檢檢測RAS基因是可行的替代方法。微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）是晚期結直腸癌對免疫檢查點抑制劑反應的重要標誌物，近期一項研究比較了1145個樣本的液體活檢與組織活檢的MSI數據，一致性高達98.4%[10]。
目前，液體活檢與組織活檢的一致性和臨床有效性雖未得到完全確認，但隨著液體活檢在大樣本臨床研究中的不斷探索和應用，其準確性和臨床實用性有望得到進一步提高。需要指出的是，目前組織樣本所提供的病理學診斷和蛋白表達等信息仍是液體活檢無法提供的，因此液體活檢仍不能完全替代組織活檢。
2 結直腸癌篩查與早期診斷
目前，我國結直腸癌的早期篩查方法主要包括直腸指檢、糞便隱血試驗和腫瘤標誌物檢測等，但靈敏度和特異度均有限[11]。而結腸鏡作為一項高成本、有創性且依從性較差的檢查，難以成為篩查工具。液體活檢的高靈敏度和非侵入性特點使其有望成為早期篩查的理想選擇。但在低腫瘤負荷的情況下，ctDNA和CTCs等在外周血中的濃度較低，必須有足夠敏感的檢測方法才能夠識別腫瘤，如基於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）的BEAMing方法、微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和二代基因測序（next generation sequencing，NGS）。2018年美國臨床腫瘤學會胃腸腫瘤研討會上，來自中國臺灣地區長庚紀念醫院的研究團隊利用CMx平臺檢測CTCs數目，對結直腸癌癌前病變的檢出準確率達到84%，癌症的檢出準確率高達88%[12]。Yang等[13]研究則提示ctDNA對結直腸癌的檢出率明顯高於目前常用的腫瘤標誌物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等。另有研究表明，聯合檢測細胞遊離DNA（cell free DNA，cfDNA）和CEA可顯著提高早期結直腸癌、癌前息肉的靈敏度和特異度[14,15]。
由於腫瘤患者的表觀遺傳學特徵常在疾病早期發生改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾等，因此通過檢測ctDNA中特異基因的表觀遺傳學變化，可更早地發現腫瘤，提高靈敏度。研究表明SEPT9基因甲基化與結直腸癌的發病機制密切相關，近年來多項研究通過檢測外周血SEPT9甲基化水平，用於結直腸癌篩查和早期診斷，靈敏度為30%～75%，特異度接近90%[16-18]。其他cfDNA標誌物如5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）等，對於結直腸癌亦有較高的診斷價值，並優於傳統生物標誌物[19]。但以上研究多為小樣本病例對照和隊列研究，具有一定的侷限性。2020年中山大學腫瘤防治中心發表的一項研究顯示，基於ctDNA甲基化標誌物的結直腸癌診斷模型準確率高達96%，進一步在1493例高危人群的前瞻性隊列中驗證結果提示，單個ctDNA甲基化標誌物對早期腸癌診斷的靈敏度高達89.7%，對進展期腺瘤的檢出靈敏度也達到33.3%，是非常有應用前景的結直腸癌早篩手段[20]。
以上研究結果提示，採用液體活檢技術篩查早期結直腸癌或癌前病變仍處於探索階段，更廣泛的臨床應用需要更多循證醫學證據的支持。目前大量的臨床研究正在進行中，如GRAIL平臺（NCT02889978）的循環無細胞基因組圖譜研究（CCGA），以及針對結直腸癌的AI-EMERGE前瞻性研究（NCT03688906）等，期待未來液體活檢在結直腸癌的早期篩查、早期診斷領域有更好的應用前景。
3 術後微小殘留病和復發監測
微小殘留病指癌症在治療後持續存在，但影像學檢查暫時無法檢測，是癌症進展和復發的隱匿階段。既往多采用血清腫瘤標誌物進行監測，但靈敏度和特異度均不高。近年研究結果提示，通過外周血CTCs或ctDNA檢測微小殘留病是監測腫瘤復發的有效手段，較傳統的影像學檢查可提前數月發現疾病復發[21]。一項前瞻性單中心研究分析了183例非轉移性結直腸癌患者的血液，發現44例（24%）患者術前血液中≥1個CTCs/30 ml，且與不良預後相關[22]。另有小樣本研究提示治療後CTCs計數的增加與轉移和復發相關，且可早於臨床證據數月出現，準確性明顯高於CEA等[23]。
除CTCs外，ctDNA檢測也可監測腫瘤復發。一項前瞻性研究納入了230例行根治性手術的Ⅱ期結腸癌患者，術後ctDNA陽性患者有79%（11/14）出現復發，陰性者僅9.8%（16/164）復發（HR＝18，95%CI：7.9～40.0，P＜0.001)，且完成輔助化療後ctDNA陽性者的無復發生存（relapse free survival，RFS）時間明顯縮短[24]。Ⅲ期結直腸癌的研究同樣提示，術後ctDNA陽性患者的RFS時間短於陰性患者，化療後ctDNA陽性患者的復發風險顯著高於陰性患者（HR＝6.8，P＜0.001）[25,26]。除定性檢測ctDNA外，通過檢測ctDNA中特定基因突變、異常甲基化或結構變異等，亦可監測結直腸癌復發。Ryan等[27]通過對ctDNA中KRAS2基因突變檢測，發現27%（16/60）的結直腸癌患者術後KRAS2突變陽性，其中63%（10/16）復發，而KRAS2陰性患者中僅2%（1/44）復發（OR＝71.7，95%CI：7.7～663.9，P＜0.001）。Diehl等[28]通過連續檢測18例結直腸癌患者術後血漿ctDNA中APC、TP53和KRAS等基因突變情況來判斷腫瘤復發，其靈敏度和特異度分別為56%和99%。
Reinert等[29]開發的基於ctDNA的個體化檢測方法，對11例結直腸癌患者採用體細胞結構變異（somatic structure variation，SSV）作為監測指標，結果提示ctDNA較傳統影像學可提前10個月檢測到術後復發，其靈敏度和特異度均高達100%。最近來自法國的IDEA-FRANCE臨床研究分析了Ⅲ期結直腸癌輔助化療前的ctDNA對不同治療策略和結局的影響，發現ctDNA陽性患者輔助化療6個月與ctDNA陰性患者輔助化療3個月效果相似，而ctDNA陽性患者如僅接受3個月輔助化療，預後最差[30]。這一結果提示ctDNA作為重要的預後指標，可作為制訂個體化輔助治療決策的重要參考依據。
綜上所述，雖然目前的研究結果均提示檢測CTCs和ctDNA可早期發現腫瘤復發，但將其應用於臨床尚需一定時間。ctDNA陽性雖然提示預後不良，但其對輔助治療決策的影響目前尚不清楚，仍需在更大樣本研究中加以驗證。對於術後患者，提前對CTCs或ctDNA陽性患者進行治療性干預，較傳統影像學提示覆發時再進行干預，能否帶來更好的治療結局，目前尚缺乏有力的數據支持，仍需進一步研究加以證實。
4 個體化用藥指導和繼發耐藥性監測
個體化用藥的前提是通過精準的檢測手段，提供完整且實時的基因和分子層面信息。根據現有研究結果，晚期結直腸癌患者的ctDNA檢測對於結直腸癌常見熱點突變如RAS、RAF、HER-2和MSI狀態等，與腫瘤組織具有高度一致性，根據液體活檢結果制訂的臨床決策，其治療結局與組織活檢高度一致[8-10]。這些都表明液體活檢技術可作為組織活檢的替代方法，成為結直腸癌個體化用藥指導的有力手段。
然而，腫瘤治療的一大難點是抗腫瘤藥物的繼發性耐藥問題。如何早期發現耐藥，明確耐藥原因，尋找克服耐藥的方法，是進一步提高療效的關鍵所在。相比組織活檢，液體活檢更易動態連續評估，有助於提前發現耐藥性變異並獲得完整的耐藥機制視圖，為制訂後續治療方案提供重要信息。以5-FU為基礎的化療是轉移性結直腸癌患者的重要治療方案，胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）是5-FU代謝的重要酶，癌細胞中TYMS水平升高與耐藥性相關[31]。Abdallah等[32]研究表明通過實時動態監測CTCs中TYMS的變化可預測5-FU耐藥情況。除化療耐藥外，靶向藥物應用過程中也會出現耐藥性克隆或突變。Misale等[33]研究證實，結直腸癌患者中的繼發性KRAS突變是抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單抗耐藥的驅動因素，通過ctDNA檢測，可在60%的病例中檢測到繼發性KRAS突變，較影像學檢查發現疾病進展提前近10個月，儘早聯合MEK抑制劑可延緩或部分逆轉對EGFR單抗的耐藥性，從而改善患者預後。後續多項研究相繼證實了連續動態液體活檢可突破組織活檢的侷限性，及早發現耐藥現象[34,35]。最近一項前瞻性隊列研究首次直接比較了接受靶向治療耐藥後的42例胃腸道腫瘤患者的液體活檢和組織活檢在確定癌症耐藥性方面的性能。結果顯示，液體活檢能更頻繁地發現臨床相關耐藥性突變，其中78%的匹配病例在組織活檢中並未發現，突出了液體活檢在獲得性耐藥檢測中的潛在優勢[36]。
然而，通過液體活檢檢測到的耐藥性改變與影像學提示疾病進展之間的時間窗目前報道尚不一致，何時應針對耐藥現象進行干預仍是未解決的難題，需要更多的研究提供更多依據。
5 小結與展望
多項研究表明，與傳統組織活檢比較，液體活檢在結直腸癌的早期篩查、檢測微小殘留病、預測療效和監測耐藥性等方面，具有非侵入性、實時動態和更全面等優勢。但就目前而言，將其廣泛應用於臨床實踐仍存在諸多問題和挑戰，如方法學上如何克服血漿中ctDNA水平過低和細胞衰老對循環分子標誌物的影響，應選擇多大的基因組合及優選哪些標誌物作為檢測靶點，以及缺乏行業標準明確其靈敏度和特異度等。此外，液體活檢提供的早期復發或耐藥證據是否足以支持改變治療決策，尚需大規模的前瞻性研究來驗證。
總之，液體活檢作為未來精準醫學的發展方向，相信其技術瓶頸終會被突破，屆時液體活檢技術將更好地幫助臨床醫生，為腫瘤患者提供更精準的個體化治療策略。
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