本文作者：汪楠，刘静，张俊（上海交通大学医学院附属瑞金医院 肿瘤科，上海 200025）
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【摘要】 随着精准医学时代的来临，肿瘤样本的分子表达谱已成为判断预后、制订个体化治疗策略、监测肿瘤复发和耐药的重要依据。相较于组织活检，液体活检技术因其无创性、安全性、全面性和实时动态性等特点，在分子检测领域得到越来越广泛的关注和应用。本文围绕液体活检技术在结直肠癌中的研究进展做一综述，其中包括与组织活检的一致性、早期筛查、监测复发、个体化用药指导和耐药性监测等，并对其局限性和未来发展方向加以展望。
【关键词】 结直肠癌；液体活检；复发；继发性耐药
《2018年全球癌症统计报告》显示，结直肠癌的发病率和死亡率位列所有肿瘤的第3位和第2位[1]，
严重威胁公众健康。虽然早期结直肠癌患者术后5年生存率高达80%～90%，但伴远处转移的结直肠癌患者生存仍不乐观，5年生存率约为14%[2]。结直肠癌高死亡率的主要原因在于其早期筛查困难，晚期治疗手段有限，且缺乏有效的疗效评估和耐药监测手段。
随着精准医学时代的来临，肿瘤样本的分子表达谱已成为判断预后、指导个体化用药和监测耐药性的重要手段。但传统的肿瘤组织活检仍具有一定局限性：部分患者标本获取困难；肿瘤时空和空间异质性导致单次活检无法获取基因谱的全貌及动态监测疾病变化；活检的有创性和风险限制了多次获取标本的可行性。肿瘤组织活检的替代方法——液体活检技术是指从以血浆为代表的体液样本中分离和分析肿瘤衍生物质，包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环RNA和外泌体（exosomes）等，因其具有无创性、安全性、全面性和实时动态性等特点而越来越受到关注。本文就近年来液体活检技术在结直肠癌中的研究进展做一综述。
1 液体活检与组织活检的一致性
虽然液体活检技术以其独特的优势迅速发展，但其临床应用仍存在争议和质疑，主要原因是液体活检与组织活检的一致性尚未得到完全肯定。Razavi等[3]使用超深度测序发现超过50%的ctDNA突变是假阳性，且与组织突变的一致性不足1/4，另有研究指出不同机构液体活检所得到的结果一致性较低[4]。原因包括样本量较小不具代表性，组织活检与液体活检采样时间不同，治疗期间诱导克隆性造血相关突变增多进而干扰ctDNA检测等。
近年来，越来越多的大规模研究结果相继证实，液体活检和组织活检的一致性可达80%～90%，尤其是对治疗有意义的驱动基因变异[5-7]。Schmiegel等[8]研究证实了结直肠癌血浆ctDNA检测RAS突变和组织活检结果一致性达91.8%。Normanno等[9]对340例接受西妥昔单抗联合FOLFIRI方案[（伊立替康＋5-氟尿嘧啶（5-FU）＋亚叶酸钙]治疗的转移性结直肠癌患者进行检测，发现肿瘤组织与液体活检的RAS基因状态和中位无进展生存时间结果相当，一致率为78.3%，表明液体活检检测RAS基因是可行的替代方法。微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）是晚期结直肠癌对免疫检查点抑制剂反应的重要标志物，近期一项研究比较了1145个样本的液体活检与组织活检的MSI数据，一致性高达98.4%[10]。
目前，液体活检与组织活检的一致性和临床有效性虽未得到完全确认，但随着液体活检在大样本临床研究中的不断探索和应用，其准确性和临床实用性有望得到进一步提高。需要指出的是，目前组织样本所提供的病理学诊断和蛋白表达等信息仍是液体活检无法提供的，因此液体活检仍不能完全替代组织活检。
2 结直肠癌筛查与早期诊断
目前，我国结直肠癌的早期筛查方法主要包括直肠指检、粪便隐血试验和肿瘤标志物检测等，但灵敏度和特异度均有限[11]。而结肠镜作为一项高成本、有创性且依从性较差的检查，难以成为筛查工具。液体活检的高灵敏度和非侵入性特点使其有望成为早期筛查的理想选择。但在低肿瘤负荷的情况下，ctDNA和CTCs等在外周血中的浓度较低，必须有足够敏感的检测方法才能够识别肿瘤，如基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的BEAMing方法、微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和二代基因测序（next generation sequencing，NGS）。2018年美国临床肿瘤学会胃肠肿瘤研讨会上，来自中国台湾地区长庚纪念医院的研究团队利用CMx平台检测CTCs数目，对结直肠癌癌前病变的检出准确率达到84%，癌症的检出准确率高达88%[12]。Yang等[13]研究则提示ctDNA对结直肠癌的检出率明显高于目前常用的肿瘤标志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等。另有研究表明，联合检测细胞游离DNA（cell free DNA，cfDNA）和CEA可显著提高早期结直肠癌、癌前息肉的灵敏度和特异度[14,15]。
由于肿瘤患者的表观遗传学特征常在疾病早期发生改变，包括DNA甲基化、组蛋白修饰等，因此通过检测ctDNA中特异基因的表观遗传学变化，可更早地发现肿瘤，提高灵敏度。研究表明SEPT9基因甲基化与结直肠癌的发病机制密切相关，近年来多项研究通过检测外周血SEPT9甲基化水平，用于结直肠癌筛查和早期诊断，灵敏度为30%～75%，特异度接近90%[16-18]。其他cfDNA标志物如5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）等，对于结直肠癌亦有较高的诊断价值，并优于传统生物标志物[19]。但以上研究多为小样本病例对照和队列研究，具有一定的局限性。2020年中山大学肿瘤防治中心发表的一项研究显示，基于ctDNA甲基化标志物的结直肠癌诊断模型准确率高达96%，进一步在1493例高危人群的前瞻性队列中验证结果提示，单个ctDNA甲基化标志物对早期肠癌诊断的灵敏度高达89.7%，对进展期腺瘤的检出灵敏度也达到33.3%，是非常有应用前景的结直肠癌早筛手段[20]。
以上研究结果提示，采用液体活检技术筛查早期结直肠癌或癌前病变仍处于探索阶段，更广泛的临床应用需要更多循证医学证据的支持。目前大量的临床研究正在进行中，如GRAIL平台（NCT02889978）的循环无细胞基因组图谱研究（CCGA），以及针对结直肠癌的AI-EMERGE前瞻性研究（NCT03688906）等，期待未来液体活检在结直肠癌的早期筛查、早期诊断领域有更好的应用前景。
3 术后微小残留病和复发监测
微小残留病指癌症在治疗后持续存在，但影像学检查暂时无法检测，是癌症进展和复发的隐匿阶段。既往多采用血清肿瘤标志物进行监测，但灵敏度和特异度均不高。近年研究结果提示，通过外周血CTCs或ctDNA检测微小残留病是监测肿瘤复发的有效手段，较传统的影像学检查可提前数月发现疾病复发[21]。一项前瞻性单中心研究分析了183例非转移性结直肠癌患者的血液，发现44例（24%）患者术前血液中≥1个CTCs/30 ml，且与不良预后相关[22]。另有小样本研究提示治疗后CTCs计数的增加与转移和复发相关，且可早于临床证据数月出现，准确性明显高于CEA等[23]。
除CTCs外，ctDNA检测也可监测肿瘤复发。一项前瞻性研究纳入了230例行根治性手术的Ⅱ期结肠癌患者，术后ctDNA阳性患者有79%（11/14）出现复发，阴性者仅9.8%（16/164）复发（HR＝18，95%CI：7.9～40.0，P＜0.001)，且完成辅助化疗后ctDNA阳性者的无复发生存（relapse free survival，RFS）时间明显缩短[24]。Ⅲ期结直肠癌的研究同样提示，术后ctDNA阳性患者的RFS时间短于阴性患者，化疗后ctDNA阳性患者的复发风险显著高于阴性患者（HR＝6.8，P＜0.001）[25,26]。除定性检测ctDNA外，通过检测ctDNA中特定基因突变、异常甲基化或结构变异等，亦可监测结直肠癌复发。Ryan等[27]通过对ctDNA中KRAS2基因突变检测，发现27%（16/60）的结直肠癌患者术后KRAS2突变阳性，其中63%（10/16）复发，而KRAS2阴性患者中仅2%（1/44）复发（OR＝71.7，95%CI：7.7～663.9，P＜0.001）。Diehl等[28]通过连续检测18例结直肠癌患者术后血浆ctDNA中APC、TP53和KRAS等基因突变情况来判断肿瘤复发，其灵敏度和特异度分别为56%和99%。
Reinert等[29]开发的基于ctDNA的个体化检测方法，对11例结直肠癌患者采用体细胞结构变异（somatic structure variation，SSV）作为监测指标，结果提示ctDNA较传统影像学可提前10个月检测到术后复发，其灵敏度和特异度均高达100%。最近来自法国的IDEA-FRANCE临床研究分析了Ⅲ期结直肠癌辅助化疗前的ctDNA对不同治疗策略和结局的影响，发现ctDNA阳性患者辅助化疗6个月与ctDNA阴性患者辅助化疗3个月效果相似，而ctDNA阳性患者如仅接受3个月辅助化疗，预后最差[30]。这一结果提示ctDNA作为重要的预后指标，可作为制订个体化辅助治疗决策的重要参考依据。
综上所述，虽然目前的研究结果均提示检测CTCs和ctDNA可早期发现肿瘤复发，但将其应用于临床尚需一定时间。ctDNA阳性虽然提示预后不良，但其对辅助治疗决策的影响目前尚不清楚，仍需在更大样本研究中加以验证。对于术后患者，提前对CTCs或ctDNA阳性患者进行治疗性干预，较传统影像学提示复发时再进行干预，能否带来更好的治疗结局，目前尚缺乏有力的数据支持，仍需进一步研究加以证实。
4 个体化用药指导和继发耐药性监测
个体化用药的前提是通过精准的检测手段，提供完整且实时的基因和分子层面信息。根据现有研究结果，晚期结直肠癌患者的ctDNA检测对于结直肠癌常见热点突变如RAS、RAF、HER-2和MSI状态等，与肿瘤组织具有高度一致性，根据液体活检结果制订的临床决策，其治疗结局与组织活检高度一致[8-10]。这些都表明液体活检技术可作为组织活检的替代方法，成为结直肠癌个体化用药指导的有力手段。
然而，肿瘤治疗的一大难点是抗肿瘤药物的继发性耐药问题。如何早期发现耐药，明确耐药原因，寻找克服耐药的方法，是进一步提高疗效的关键所在。相比组织活检，液体活检更易动态连续评估，有助于提前发现耐药性变异并获得完整的耐药机制视图，为制订后续治疗方案提供重要信息。以5-FU为基础的化疗是转移性结直肠癌患者的重要治疗方案，胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）是5-FU代谢的重要酶，癌细胞中TYMS水平升高与耐药性相关[31]。Abdallah等[32]研究表明通过实时动态监测CTCs中TYMS的变化可预测5-FU耐药情况。除化疗耐药外，靶向药物应用过程中也会出现耐药性克隆或突变。Misale等[33]研究证实，结直肠癌患者中的继发性KRAS突变是抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单抗耐药的驱动因素，通过ctDNA检测，可在60%的病例中检测到继发性KRAS突变，较影像学检查发现疾病进展提前近10个月，尽早联合MEK抑制剂可延缓或部分逆转对EGFR单抗的耐药性，从而改善患者预后。后续多项研究相继证实了连续动态液体活检可突破组织活检的局限性，及早发现耐药现象[34,35]。最近一项前瞻性队列研究首次直接比较了接受靶向治疗耐药后的42例胃肠道肿瘤患者的液体活检和组织活检在确定癌症耐药性方面的性能。结果显示，液体活检能更频繁地发现临床相关耐药性突变，其中78%的匹配病例在组织活检中并未发现，突出了液体活检在获得性耐药检测中的潜在优势[36]。
然而，通过液体活检检测到的耐药性改变与影像学提示疾病进展之间的时间窗目前报道尚不一致，何时应针对耐药现象进行干预仍是未解决的难题，需要更多的研究提供更多依据。
5 小结与展望
多项研究表明，与传统组织活检比较，液体活检在结直肠癌的早期筛查、检测微小残留病、预测疗效和监测耐药性等方面，具有非侵入性、实时动态和更全面等优势。但就目前而言，将其广泛应用于临床实践仍存在诸多问题和挑战，如方法学上如何克服血浆中ctDNA水平过低和细胞衰老对循环分子标志物的影响，应选择多大的基因组合及优选哪些标志物作为检测靶点，以及缺乏行业标准明确其灵敏度和特异度等。此外，液体活检提供的早期复发或耐药证据是否足以支持改变治疗决策，尚需大规模的前瞻性研究来验证。
总之，液体活检作为未来精准医学的发展方向，相信其技术瓶颈终会被突破，届时液体活检技术将更好地帮助临床医生，为肿瘤患者提供更精准的个体化治疗策略。
参考文献
[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6):394-424.
[2] Siegel RL, Miller KD, Fedewa SA, et al. Colorectal cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017, 67(3):177-193.
[3] Razavi P, Li BT, Brown DN, et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants[J]. Nat Med, 2019, 25(12):1928-1937.
[4] Kuderer NM, Burton KA, Blau S, et al. Comparison of 2 Commercially Available Next-Generation Sequencing Platforms in Oncology[J]. JAMA Oncol, 2017, 3(7):996-998.
[5] Corcoran RB, Chabner BA. Application of Cell-free DNA Analysis to Cancer Treatment[J]. N Engl J Med, 2018, 379(18): 1754-1765.
[6] Adalsteinsson VA, Ha G, Freeman SS, et al. Scalable whole-exome sequencing of cell-free DNA reveals high concordance with metastatic tumors[J]. Nat Commun, 2017, 8(1):1324.
[7] Schrock AB, Pavlick D, Klempner SJ, et al. Hybrid Capture-Based Genomic Profiling of Circulating Tumor DNA from Patients with Advanced Cancers of the Gastrointestinal Tract or Anus[J]. Clin Cancer Res, 2018, 24(8):1881-1890.
[8] Schmiegel W, Scott RJ, Dooley S, et al. Blood-based detection of RAS mutations to guide anti-EGFR therapy in colorectal cancer patients: concordance of results from circulating tumor DNA and tissue-based RAS testing[J]. Mol Oncol, 2017, 11(2):208-219.
[9] Normanno N, Esposito Abate R, Lambiase M, et al. RAS testing of liquid biopsy correlates with the outcome of metastatic colorectal cancer patients treated with first-line FOLFIRI plus cetuximab in the CAPRI-GOIM trial[J]. Ann Oncol, 2018, 29(1):112-118.
[10] Willis J, Lefterova MI, Artyomenko A, et al. Validation of Microsatellite Instability Detection Using a Comprehensive Plasma-Based Genotyping Panel[J]. Clin Cancer Res, 2019, 25(23):7035-7045.
[11] Collins JF, Lieberman DA, Durbin TE, et al. Accuracy of Screening for Fecal Occult Blood on a Single Stool Sample Obtained by Digital Rectal Examination: A Comparison with Recommended Sampling Practice[J]. Ann Intern Med, 2005, 142:81-85.
[12] Wen-Sy Tsai1 AN, Segurado O, Chang YC, et al. Prospective Clinical Study of Circulating Tumor Cells for Colorectal Cancer Screening[C]. San Francisco: ASCO-GI, 2018.
[13] Yang YC, Wang D, Jin L, et al. Circulating tumor DNA detectable in early- and late-stage colorectal cancer patients[J]. Biosci Rep, 2018, 38(4). pii:BSR20180322
[14] Flamini E, Mercatali L, Nanni O, et al. Free DNA and carcinoembryonic antigen serum levels: an important combination for diagnosis of colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(23):6985-6988.
[15] Mead R, Duku M, Bhandari P, et al. Circulating tumour markers can define patients with normal colons, benign polyps, and cancers[J]. Br J Cancer, 2011, 105(2):239-245.
[16] Toth K, Galamb O, Spisak S, et al. The influence of methylated septin 9 gene on RNA and protein level in colorectal cancer[J]. Pathol Oncol Res, 2011, 17(3):503-509.
[17] Jin P, Kang Q, Wang X, et al. Performance of a second-generation methylated SEPT9 test in detecting colorectal neoplasm[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2015, 30(5):830-833.
[18] Church TR, Wandel M, Lofton-Day C, et al. Prospective evaluation of methylated SEPT9 in plasma for detection of asymptomatic colorectal cancer[J]. Gut, 2014, 63(2):317-325.
[19] Li W, Zhang X, Lu X, et al. 5-Hydroxymethylcytosine signatures in circulating cell-free DNA as diagnostic biomarkers for human cancers[J]. Cell Res, 2017, 27(10):1243-1257.
[20] Luo H, Zhao Q, Wei W, et al. Circulating tumor DNA methylation profiles enable early diagnosis, prognosis prediction, and screening for colorectal cancer[J]. Sci Transl Med, 2020, 12(524). pii:eaax7533.
[21] Pantel K, Alix-Panabieres C. Liquid biopsy and minimal residual disease-latest advances and implications for cure[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2019, 16(7):409-424.
[22] Van Dalum G, Stam GJ, Scholten LF, et al. Importance of circulating tumor cells in newly diagnosed colorectal cancer[J]. Int J Oncol, 2015, 46(3):1361-1368.
[23] Garrigos N, Gallego J, Guillen-Ponce C, et al. Circulating tumour cell analysis as an early marker for relapse in stage Ⅱ and Ⅲ colorectal cancer patients: a pilot study[J]. Clin Transl Oncol, 2010, 12(2):142-147.
[24] Tie J, Wang Y, Tomasetti C, et al. Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and predicts recurrence in patients with stage Ⅱ colon cancer[J]. Sci Transl Med, 2016, 8(346):346ra92.
[25] Tie J, Cohen J, Wang Y, et al. Serial circulating tumor DNA (ctDNA) analysis as a prognostic marker and a real-time indicator of adjuvant chemotherapy (CT) efficacy in stageⅢ colon cancer (CC)[J]. J Clin Oncol, 2018, 36(15_suppl):3516.
[26] Tie J, Cohen JD, Wang Y, et al. Circulating Tumor DNA Analyses as Markers of Recurrence Risk and Benefit of Adjuvant Therapy for Stage Ⅲ Colon Cancer[J]. JAMA Oncol, 2019. [Epub
ahead of print]
[27] Ryan BM, Lefort F, McManus R, et al. A prospective study of circulating mutant KRAS2 in the serum of patients with colorectal neoplasia: strong prognostic indicator in postoperative follow up[J]. Gut, 2003, 52(1):101-108.
[28] Diehl F, Schmidt K, Choti MA, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics[J]. Nat Med, 2008, 14(9):985-990.
[29] Reinert T, Scholer LV, Thomsen R, et al. Analysis of circulating tumour DNA to monitor disease burden following colorectal cancer surgery[J]. Gut, 2016, 65(4):625-634.
[30] Taieb J, Taly V, Vernerey D, et al. Analysis of circulating tumour DNA (ctDNA) from patients enrolled in the IDEA-FRANCE phaseⅢ trial: Prognostic and predictive value for adjuvant treatment duration[J]. Ann Oncol, 2019, 30(Suppl_5):867.
[31] Phan J, Steadman DJ, Koli S, et al. Structure of human thymidylate synthase suggests advantages of chemotherapy with noncompetitive inhibitors[J]. J Biol Chem, 2001, 276(17): 14170-14177.
[32] Abdallah EA, Fanelli MF, Buim ME, et al. Thymidylate synthase expression in circulating tumor cells: a new tool to predict 5-fluorouracil resistance in metastatic colorectal cancer patients[J]. Int J Cancer, 2015, 137(6):1397-1405.
[33] Misale S, Yaeger R, Hobor S, et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer[J]. Nature, 2012, 486(7404):532-536.
[34] Diaz LA Jr, Williams RT, Wu J, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers[J]. Nature, 2012, 486(7404):537-540.
[35] Khan KH, Cunningham D, Werner B, et al. Longitudinal Liquid Biopsy and Mathematical Modeling of Clonal Evolution Forecast Time to Treatment Failure in the PROSPECT-C Phase Ⅱ Colorectal Cancer Clinical Trial[J]. Cancer Discov, 2018, 8(10):1270-1285.
[36] Parikh AR, Leshchiner I, Elagina L, et al. Liquid versus tissue biopsy for detecting acquired resistance and tumor heterogeneity in gastrointestinal cancers[J]. Nat Med, 2019, 25(9):1415-1421.
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