撰文 | 雪月
随着科研中对流式检测的需求越来越高，扩展荧光染料可用种类也相应得到发展。扩展可用荧光染料范围的主要方法是将串联共轭物添加到现有的一级荧光团上（如APC荧光团与Cy7缀合物串联产生APC-Cy7）。串联共轭物通过其一级荧光团的共振能量转移（Forster resonance energy transfer FRET）激活，改变一级荧光团的发射光谱。串联荧光团的应用为定义更多细胞群提供便利，以至于它们现在已成为开发合适的流式细胞仪考虑的因素之一，特别是随着检测> 30种不同荧光团的流式细胞仪的出现。
但是串联染料会发生降解或者失去FRET能力，从而导致变成一级荧光光谱发射，如APC-Cy7降解为APC。串联降解是一种公认现象。已经有些研究探索不同染色条件对串联染料稳定性的影响，如温度、光照、固定条件、血清等。
串联荧光染料降解示意图
近日，来自美国爱荷华大学的Vladimir Badovinac在Immunity上发表题为 Worry and FRET: ROS Production Leads to Fluorochrome Tandem Degradation and impairs Interpretation of Flow Cytometric Results 的文章。该文章指出ROS会引起串联荧光染料降解，对流式细胞术结果的分析产生较大影响。而在染色缓冲液中加入还原剂则能抑制荧光染料串联降解。
作者发现他们在进行盲肠结扎和穿刺诱导的脓毒症模型（cecal ligation and puncture CLP）时，当使用串联染料时，相较于对照组（sham /control），会出现多个细胞亚群。作者认为染色缓冲液中某些物质会导致串联降解，而且这种现象随着粒细胞数量增加变得更明显。经过探究作者发现在染色缓冲液中的氧化剂如加入H2O2能促进串联降解，而加入还原剂如2-巯基乙醇 BME或者维生素C则能够抑制。这也与粒细胞产生过多ROS一致。
APC-efluor780串联降解导致在APC通道中可检测到APC信号
为了确定在其他炎性感染疾病的分析中是否也存在这个现象，作者用感染了非致死性的约氏疟原虫17XNL（PyXNL）（疟疾）或李斯特菌单核细胞增生症-两种引起强烈ROS产生的感染疾病模型验证发现，ROS确实能够引起荧光染料串联降解。
接下来作者在染色缓冲液中加入还原剂以抑制串联降解。一个是在染色缓冲液中加入BME，选择BME是因为它在完全培养基配方中会使用。另一种是维生素C。还原剂的添加能够限制串联荧光染料的降解，而不会对对照产生不利影响。
但是，作者指出他们还没有详尽列出其他有助于控制串联染料降解的修饰物质。而且他们的评估不能区分是串联染料的脱离还是仅仅破坏串联的FRET能力。以后研究此机制的工作可能会允许创建更好的稳定的荧光染料，以最大程度地减少此类干扰结果稳定性的问题。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761320300741?via%3Dihub
制版人：珂
閱讀更多 BioArt 的文章
