DNA甲基化是哺乳動物的關鍵表觀遺傳機制，其中5-甲基胞嘧啶（5mC）是最常見的DNA修飾之一。5mC對於哺乳動物的早期發育至關重要，在譜系特異性基因沉默、基因組印跡和抑制重複元件中起著核心作用。與之相反，在原核生物中5mC是罕見的，而N6-甲基腺嘌呤（6mdA）是其DNA甲基化的常見形式。
6mdA是細菌限制性修飾系統的基本組成部分，可使原核生物區分良性宿主DNA和潛在致病性非宿主DNA。目前在哺乳動物中缺乏已知的限制性修飾系統。近年來，Cell、Nature、Genome Res有多項研究報道，6mdA也存在於哺乳動物中，如小鼠胚胎幹細胞、人類神經膠質瘤細胞。但仍有研究顯示該結果存在不確定性。
近日，瑞典Linköping大學科學家發表的一項研究成果推翻了這一結論。該研究團隊在Science Advances發表文章“No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals”。結果顯示，迄今為止發表的研究證據不足以證明在哺乳動物中存在6mdA這種細菌表觀遺傳修飾，此前哺乳動物細胞存在6mdA的研究很可能被汙染。
來源：Science Advances
最初，為了進一步闡明6mdA在哺乳動物細胞譜系中的作用，瑞士研究團隊在體外將人幼稚T輔助細胞（NTH）分化成T輔助細胞亞群（TH），利用已發表數據進行了全面生物信息學分析和新穎的實驗。令人意外的是，他們發現TH細胞分化過程中6mdA的丰度並沒有全局變化，並觀察到6mdA在分化T細胞中的水平與非甲基化全基因組擴增DNA相同（圖1A），表明在人T細胞中不存在可檢測水平的6mdA。此外，研究人員在所有小鼠或人類組織中均未能檢測到6mdA，這些樣本均與缺少6mdA的全基因組擴增DNA對照中的信號相似（圖1B）。這一發現與此前關於哺乳動物存在6mdA的結論相反，引起了研究團隊的注意。
圖1.免疫印跡顯示在體外分化過程中人CD4+ T細胞（A）、人和小鼠原代DNA（B）中相對6mdA丰度。培養細胞系（上），全基因組擴增對照（中）和支原體汙染（下）。來源：Science Advances
隨後，研究團隊分析了從六個人類細胞系中分離出的DNA中的6mdA，並鑑定出兩個具有高於背景噪聲水平的6mdA水平的細胞系。出乎意料的是，兩種單獨的T細胞系培養物具有不同的6mdA水平，表明此前研究觀察到的6mdA信號並非細胞類型本身所固有的。經過進一步分析，研究團隊證實兩個6mdA水平升高的細胞系已被支原體屬汙染。（圖2）支原體屬一種常見的富含6mdA的細菌細胞培養物。當研究人員用支原體特異性抗生素處理細胞系時，發現6mdA信號降低為全基因組擴增陰性對照水平，證實6mdA陽性信號來源於支原體屬汙染。
圖2.使用抗體試劑盒驗證支原體陽性，虛線為支原體陽性閾值。來源：Science Advances
由於未能在任何未汙染的哺乳動物DNA中檢測到6mdA，研究團隊試圖驗證已有方法的敏感性。因此，研究團隊分析了此前在哺乳動物細胞中通過DNA免疫沉澱測序、質譜和單分子實時測序定位或檢測6mdA的研究，並發現每種方法都有侷限性或缺陷。他們意識到，通過這些技術檢測到的6mdA'信號'只是噪聲。但由於一些複雜的技術問題，幾種方法中的背景噪聲不是隨機的，而是呈現出“真實”的信號。這使得表觀遺傳標記的假陽性發現率很高，也暗示著哺乳動物細胞中可能並不存在6mdA這種修飾現象。例如，對已發表MS數據的分析顯示，即使在相同物種和細胞類型中，檢測到的哺乳動物6mdA丰度也存在巨大差異（10到1000倍）。（圖3）
圖3.對已發表九項獨立質譜研究中人類、小鼠、豬和大鼠DNA中6mdA丰度數據的分析，來源：Science Advances
該研究表明，RNA和細菌汙染、抗體交叉反應性和其他技術限制已導致人們在哺乳動物DNA中錯誤地識別6mdA。隨著DNA和RNA修飾家族的不斷壯大，未知表觀遺傳修飾的丰度越來越低，即使使用多種互補方法，也存在錯誤發現的可能。因此，研究團隊建議在未來的罕見DNA修飾研究中，使用修飾和未修飾的基因組DNA標準品作為最低標準要求，並在使用前進行更全面地抗體特異性驗證。
文章通訊作者Colm Nestor表示：“在研究罕見的DNA現象時，必須非常小心地選擇使用哪種方法，並考慮是否真正在衡量存在的事物。我們認為，迄今為止發佈的研究證據不足以支持哺乳動物細胞中存在6mdA表觀遺傳修飾。”
1.No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals, 18 Mar 2020. Science Advances
https://advances.sciencemag.org/content/6/12/eaay3335
2.Researchers Find No Evidence to Support Presence of Bacterial Epigenetic Mark in Mammals
https://www.genomeweb.com/genetic-research/researchers-find-no-evidence-support-presence-bacterial-epigenetic-mark-mammals#.XndxnDMpj2c
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