撰文 | 伊凱
揭示DNA序列變異和表型差異之間的功能性關聯的是人類遺傳學的核心課題之一，也是診斷和治療遺傳病的關鍵性基礎。隨著全基因組測序技術的廣泛應用，研究者對於具有潛在生理性及病理性重要影響的人類DNA序列變異的搜尋範圍也在不斷擴大。以全基因組關聯分析研究（GWAS）為代表的統計分析研究發掘出了海量的具有統計顯著意義的非編碼序列變異，但卻無法做到像對基因編碼區域變異那樣的對所涉及之生物學機制的準確預測和鑑定。相比於直接改變蛋白質序列的非同義突變所造成之功能性後果的明確和強效，非編碼區域的序列變異可能導致的增強子-啟動子接觸抑制、轉錄因子結合擾動、染色質開放性變化及鄰近表觀修飾改變等功能性後果則極為繁雜且不確定極高。
傳統上對非編碼序列的體內生物學功能進行鑑定的方法主要依賴於外源已編輯序列的隨機整合（random integration），但這種策略往往受到基因表達位置效應（position effect）的嚴重干擾，導致結果的可重複性較低。
2020年3月12日，來自美國勞倫斯伯克利國家實驗室（Lawrence Berkeley National Laboratory）的Len A. Pennacchio、Diane E. Dickel和Axel Visel在Cell發表了題為Comprehensive In Vivo Interrogation Reveals Phenotypic Impact of Human Enhancer Variants的文章，報道了一種基於CRISPR-Cas9靶向編輯系統的高效轉基因小鼠模型，用於鑑定非編碼序列變異的功能學後果及導致的體內表型變化。
在這項課題中，作者以一種研究較為充分的人類基因增強子——極性活性區調控序列（zone of polarizing activity regulatory sequence, ZRS）為範例，詳細展示了基於CRISPR-Cas9的enSERT小鼠轉基因系統enSERT（enhancer insertion）在鑑定增強子活性和相應表型變動上的實用性。ZRS是一種肢體特異的激活音蝟因子（sonic hedgehog, Shh）基因表達的增強子，對正常肢體發育具有極為關鍵的作用。迄今為止，已有21種單核苷酸變異被發現可能改變人類ZRS的活性，使得Shh異位過表達，從而導致多指症的發生。
為了驗證這些在多指症患者的臨床檢查中發現的ZRS序列變異與其病症之間是否具有因果關聯，作者分別將單核苷酸編輯後的ZRS序列通過enSERT系統與LacZ報告基因經由CRISPR-Cas9共同特異性地整合至小鼠受精卵的相應基因組位點上，然後通過胚胎肢端LacZ的染色深淺和位置判斷ZRS的激活程度和激活模式。結果發現，其中15種單核苷酸變異均能導致ZRS在肢芽前緣的異位過度激活，表明這些突變的確具有導致肢端發育異常尤其是多指症的潛力。
接下來，為了進一步確證上述序列變異能夠直接導致多指症的發生，作者選擇了其中7個具有異位激活Shh表達的變異，利用CRISPR-Cas9系統直接對小鼠ZRS序列對應位點進行編輯，形成敲入模型（knock-in model）。結果發現，其中5個序列變異都能夠直接導致小鼠胚胎形成額外的手指。這無疑展示了enSERT系統在快速篩選鑑定可能導致重要生理病理表型的非編碼序列變異上的獨特優勢。
最後，為了體現enSERT系統在預測和識別未知序列變異的功能學後果上的強大能力，作者對整個ZRS序列做了系統性的隨機編輯和體內整合，共包含17個40鹼基隨機同突變和43個16鹼基同突變。通過基於LacZ的染色分析對ZRS活性進行鑑定，作者發現40鹼基同突變有高達82%的幾率使得ZRS完全失活，而在剩餘18%的案例中，ZRS活性也受到顯著抑制。由於其可能存在由突變壓力陡增導致的過度抑制效應，作者認為16鹼基同突變的結果或許更有現實意義。的確，在這一組結果中，僅有26%的突變導致ZRS失活，44%的導致活性降低，而有23%的ZRS活性維持不變；最為有趣的是，在剩餘7%的案例中甚至發生了ZRS的活性增強。
這一結果暗示了即使在ZRS這一已經得到廣泛研究的增強子序列中，仍然存在部分可能導致多指症發生的序列變異尚未得到識別和鑑定。而enSERT系統在這一應用方向中，無疑便是可以用作初步篩選的一件利器。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.031
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