病毒疫苗研發的基本流程

一、疫苗研發方案

（Ⅰ）小鼠細胞培養疫苗實驗階段

細胞培養疫苗有細胞培養滅活疫苗和細胞培養活疫苗兩類，前者多以強毒毒株培養增殖製造，後者則用弱毒毒株增殖生產，兩者的製造程序既有相同之處，又有區別。由於病毒不同與疫苗性質不同，所採用的細胞及細胞培養方法也有所不同。

（一）種毒與毒種繼代

用於制苗用的種毒應經毒力、最小免疫量、安全性、無菌檢定合格，通常為凍幹品，由國家指定的苗毒種保藏部門檢定分發。

領取的種毒應按規定在細胞繼代培養適應後用作毒種，制苗用毒種應按規定控制在一定代數以內，或為溼毒毒種，或為凍幹毒種。

（二）細胞製備

製造疫苗用的細胞大體為原代細胞和傳代細胞兩類，根據病毒種類、疫苗性質與工藝流程選擇不同的細胞。 選擇的依據包括：病毒的適應性高、毒價高、細胞來源方便、製備簡單、生命力強。 如脊髓灰質炎活疫苗選擇vero細胞；狂犬病弱毒細胞適應疫苗採取BHK21細胞增殖病毒豬瘟兔化弱毒牛睪丸細胞疫苗採用犢牛睪丸原代細胞等。 培養細胞和增殖病毒用的營養液又稱培養液，通常分為細胞培養用的生長液和病毒增殖用的維持液，兩者不同的之處通常只是生長液內含有5%-10%的血清；維持液血清濃度為2%-5%。 不同細胞所需的營養成分和生長條件不盡相同。 目前常用的細胞培養方法為靜止培養和轉瓶培養，至於微載體培養和懸浮培養在我國尚處於試驗之中。

（三）接毒與收穫

病毒接種培養有同步與異步之分，前者在細胞分裝同時或不久接種毒種，進行培養，如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細小病毒)；後者在細胞形成單層後接種毒種，如流行性乙型腦炎細胞培養疫苗。通常在細胞形成單層後傾去培養液，按1%-2%量接種毒種，經吸附後加入維持液繼續進行培養，待出現70%-85%以上細胞病變時即可收穫。

病毒培養液收穫時間和方法依疫苗性質而定，可將培養瓶凍融數次後收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培養過程中可收穫5-7次毒液，細胞毒液經無菌檢驗、毒價測定合格後供配苗用。病毒在易感動物體內可大量增殖，但在各器官組織、部位中增殖病毒的量卻有很大的差異，利用病毒增殖迅速、含毒量高的組織製造的疫苗稱為組織疫苗(tissue vaccine)。

動物組織疫苗包括動物組織滅活疫苗和動物組織弱毒活苗兩類，前者多數由強毒株製造，如豬瘟結晶紫疫苗、狂犬病羊腦組織疫苗；後者均以弱毒株生產，如豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗、牛瘟兔化弱毒組織疫苗等。

（一）動物選擇

動物質量直接影響到組織疫苗的質量，特別是對疫苗的安全性和效力有著決定性的作用，動物必須符合下列標準：

(1)應該是清潔級(二級)以上的等級實驗動物，即無規定的人獸共患性病原體動物；

(2)應是對所接種病毒易感性高的動物，即在品種、年齡和體重方面合乎要求的實驗動物。

（二）種毒與接種

種毒既可用抗原性優良、致死力強的自然毒株臟器組織毒或強毒株增殖培養物，也可用弱毒株組織毒種。無論何種種毒都須經純粹、抗原性和免疫原性檢查合格後使用。

接種途徑依病毒性質和目的而異，例如豬瘟結晶疫苗，採取豬肌肉注射血液毒種；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳靜脈注射脾淋毒種；狂犬病疫苗，用兔腦毒種接種綿羊腦內途徑感染。

幾種動物常用的接種途徑如下：

1. 腦內注射：顱前後中線5mm平行線與瞳孔橫線交叉處。

2. 靜脈注射：家兔由耳靜脈注入；雞自翅下肢靜脈注入。

3. 肌肉注射：選擇腿部、胸部、臀部等肌肉豐滿處注射。

4. 皮下注射：家兔和豚鼠可選擇在腹部或後腿內注射。

5. 腹腔注射：家兔與豚鼠可選腹股溝處刺入腹腔。

（三）觀察與收穫

動物在接種感染後應每天觀察和檢查規定的各項指標，指標或項目因不同病毒而異。常規觀察、檢查的項目如食慾、精神和活動狀態、體溫、糞便、尿和血液變化等。

根據觀察的徵象和檢查的結果選出符合要求的發病動物按規定方式剖殺，採取收集含毒量高的器官組織。如豬瘟結晶紫疫苗採取發病豬的血液製備；兔出血症組織滅活疫苗採集病兔肝臟生產；狂犬病疫苗利用發病羊的羊腦組織製造。

（四）制 苗

1．組織滅活疫苗

採取收穫的組織經無菌檢驗及毒價測定合格後，按規定比例加入平衡液和滅活劑（甲醛、酚、結晶紫等）製成勻漿，然後按不同病毒的滅活溫度、時間進行滅活。如狂犬病疫苗配製按腦組織1:4加入含有甘油及1%酚蒸餾水，於360.5C滅活7天製成；豬瘟結晶紫疫苗配製，按血毒4份，結晶紫甘油溶液1份混合，於37C~38C滅活6~8天。

2. 弱毒組織疫苗

在無菌操作下剔除臟器上的脂肪與結締組織等，稱重後剪碎，加入適最保護劑製成勻漿，然後濾過扣除殘渣量，再按濾液中的實際組織量計算稀釋倍數，加入餘量保護劑和青鏈黴素500~1000U(g/ml)，充分搖勻後置0~4C冷暗處處理一定時間後作無菌檢驗與毒價測定。合格者進行分裝，冷凍真空乾燥製成凍幹疫苗。

（五）疫苗檢定，測定有效性和安全性

二、臨床前研究、臨床研究

（一）臨床前及臨床研究

新藥開發階段如下：

臨床前試驗：由製藥公司進行的實驗室和動物研究，以觀察化合物針對目標疾病的生物活性，同時對化合物進行安全性評估。這些試驗大概需要3.5 年的時間。

研發中新藥申請（Investigational New Application, IND）：在臨床前試驗完成後，公司要向FDA 提請一份IND，之後才能開始進行藥物的人體試驗。如果30 天內FDA 沒有發出不予批准的申明，此IND 即為有效。提出的IND 需包括以下內容：先期的試驗結果，後續研究的方式、地點以及研究對象；化合物的化學結構；在體內的作用機制；動物研究中發現的任何毒副作用以及化合物的生產工藝。另外，IND 必須得到制度審核部門（the Institutional Review Board）的審核和批准。同時，後續的臨床研究需至少每年向FDA 提交一份進展報告並得到准許。

臨床試驗，Ⅰ期：此階段大概需要1 年時間，由20～80 例正常健康志願者參加。這些試驗研究了藥物的安全性方面，包括安全劑量範圍。此階段的研究同時確定了藥物在體內的吸收、分佈、代謝和排洩、以及藥物的作用持續時間等項目。

臨床試驗，Ⅱ期：此階段需要約100 到300 名志願患者參與進行一些控制研究，以評價藥物的療效。這個階段大約需要2 年時間。

臨床研究，Ⅲ期：此階段持續約3 年時間，通常需要診所和醫院的1000～300 名患者參與。醫師通過對病患的監測以確定療效和不良反應。

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關鍵字: 豚鼠 細胞培養 活疫苗