第24届欧洲动物细胞技术协会（ESACT）会议论文：细胞，培养，患者，产品
题目：协调瞬时基因表达的基础：从DNA制备（通过培养基、试剂和细胞系开发）到整体工艺优化
文献出处：BMC Proceedings. 2015, 9 (Suppl 9):P18
https://doi.org/10.1186/1753-6561-9-S9-P18
背景
瞬时基因表达（TGE）有四方面的影响因素：首先，必须有易于转染的细胞系，能高丰度表达和悬浮培养（1）。其次，鉴于只有少数商品化细胞培养基支持瞬时转染和表达，强烈建议选择最合适的培养基（2）。第三，质粒DNA的质量、来源和骨架有重要影响[3]。第四，选择合适的转染试剂对于高产起着重要作用。
在这项工作中，我们总结了我们最近开发的一种新型的TGE系统，用于在HEK细胞中进行有效的瞬时转染和表达。InVivo BioTech Services与emp Biotech公司合作开发了一种极低细胞毒性的转染试剂，与Xell AG合作设计了可用于转染和生产的培养基。建立TGE优化的HEK细胞系（HEK-INV）和用于相应载体的大规模质粒制备的方法完善了优化的生产平台。它易于应用，可扩展，并支持大规模转染，可在几天内产生克级的IgG。
材料与方法
哺乳动物细胞在XellvivoTM培养基（货号861-0001，Xell AG）中培养和转染，伴随条件为37℃、5％CO2、185rpm搅拌速度和50mm轨道直径。转染方法如下：2μgDNA/细胞+INVect转染试剂（货号FK-0101-M001.0-001，emp Biotech GmbH）转染5×106细胞/ mL，其中INVect与DNA的比例为6：1（w / w）；或转染试剂采用25kDa L-PEI，PEI与DNA比例2：1（w / w），8mL培养液，50mL生物反应管。IgG1的表达分别在125mL转瓶中的30mL培养液或500mL转瓶中的150mL培养液中进行，并用蛋白A亲和层析定量。定向进化是参考Majors等人2009年的研究[4]进行。具体来说，是进行了数轮的迭代进化，随后进行了最优性状分析、细胞筛选和细胞回收。相应的流式细胞术分析采用了Bio-Rad S3细胞分选仪。
与微型制备规模的商业试剂盒相比，我们对几种大肠杆菌菌株和培养基进行了小规模的筛选，以与商品化试剂盒相比，获得高产、高质和DNA制备的灵活性。采用了可重复使用且可规模升级的阴离子交换器进行纯化。对于大规模质粒制备，采用了Äktaprime色谱系统对6L悬浮液进行了裂解、澄清和纯化。最后，用DoE软件和方法对TGE过程进行了优化。
结果
使用在三种不同培养基中培养的，在产量和质量方面比较至少两种质粒。
对于不同的大肠杆菌菌株，我们比较了三种培养基和至少两种质粒，评价了质粒产量和质量。在质量方面，超螺旋单体DNA的量高度依赖于宿主菌株，绝对产量则受培养基的影响。采用了阴离子交换法进行了纯化。4次独立的试验显示，产量平均为40mg质粒DNA / 每L培养液（图1A）。
然而，出乎意料的是，高达50,000 EU/ mL的内毒素水平似乎不影响细胞活力、转染效率，对生产能力也没有显著影响。
从哺乳动物培养的基础培养基开始，我们与Xell AG公司合作，开发了支持瞬时转染和高滴度表达的新型培养基。通过逐步筛选和优化培养基组分实现了更高的细胞生长，转染效率和生产能力。最终的培养基配方使IgG1的生产力提高了4倍（图1B）。
我们利用定向进化，筛选出用于TGE过程的优化的宿主细胞系。与亲本宿主细胞系相比，其IgG1的生产力增加了3倍（图1C）。
常用的转染试剂如聚乙烯亚胺（PEI）在较高浓度时具有较大的细胞毒性。这使最大的可转染细胞密度受到限制，因为转染时需要约0.5pgDNA/细胞。要达到类似的生产水平，25kDa L-PEI需要更大的细胞培养容器。新开发的INVect转染试剂对哺乳动物细胞的瞬时转染显示出低细胞毒性，并且具有极高转染效率，24小时后最高达90％。与25kDa线性PEI相比，INVect转染后细胞目的蛋白的表达量更高，IgG生产力升高了2倍（图1D）。
所有开发方面的组合可采取两种过程策略。一方面，INVect的低毒性和新培养基系统的性能允许在高细胞密度（约1-4x107细胞/ mL）下转染和培养，实现高达850mg/L的抗体滴度（表1）。另一方面，有可能以高密度（约4x107细胞/ mL）建立第一个高产量伪灌注TGE生产过程，这使得每个反应器体积和每天的最大空间时间产率高达200mg IgG。
表1. 在具有不同设置和规模的独立实验中瞬时表达单克隆抗体
伪灌注
分批培养
流加培养
存活细胞的密度
40 x106cell/mL
5 x106cell/mL
20 x106cell/mL
体积（ml）
10
30-3000
30-300
时间（天）
10
7
6
产量（mg/L）
240*
400
850
*最终抗体浓度in perfundate
结论
总之，InVivo的TGE系统包括发达的细胞系和载体系统、新型转染试剂以及独特的定制培养基，所有这些都协同优化，可高效生产重组蛋白。这种流水线工艺是应用在早期开发阶段，下一步即产物鉴定以及临床试验前的克级规模生产。
此外，还开发了一种伪灌注TGE方法，用于生产有毒或不稳定的产品，如酶或疫苗。最后，采用了浓缩定制的养料补充剂的生产工艺更简明，使抗体滴度高达850mg/L。随后对转染增强剂的筛选显示出有希望的结果并表明更进一步改进的潜力。
参考文献
1. Hacker DL, Kiseljak D, Rajendra Y, Thurnheer S, Baldi L, Wurm FM: Polyethyleneimine-based transient gene expression processes for suspension-adapted HEK-293E and CHO-DG44 cells. Protein Expr Purif. 2013, 92: 67-76.
2. Geisse S: Reflections on more than 10 years of TGE approaches. Protein Expr Purif. 2009, 64: 99-107.
3. Rozkov A, Larsson B, Gillstrom S, Bjornestedt R, Schmidt SR: Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture. Biotechnol Bioeng. 2008, 99: 557-566.
4. Majors BS, Chiang GG, Betenbaugh MJ: Protein and Genome Evolution in Mammalian Cells for Biotechnology Applications. Mol Biotechnol. 2009, 42: 216-223.
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