03.07 MDS诊治中的应用研究

作者：程焕臣，刘生伟，刘宇，赵雪飞，李蔚，邱林，马军

单位：哈尔滨市第一医院血液病肿瘤研究所

急性髓系白血病( AML) 和骨髓增生异常综合征( MDS) 均是临床异质性疾病，其总生存期差别较大，且MDS还易向 AML转化，但临床的多样性大多体现在许多有预后和治疗价值的基因突变上。如FLT3-ITD是中危AML中独立的预后不良因素而CEBPA 是一预后良好因素，SF3B1突变阳性的MDS患者的预后评估为低危等。但基因突变所用的一代测序( 即 Sanger 测序) 法1次仅能对1个基因的1个片段进行测序，同时要测许多基因突变时费时费力，并且一代测序敏感性大约为20% ，不能检测出低频率突变。

近来对基因突变谱的研究表明，白血病的克隆演变过程是一个顺序性、多步骤、多基因突变的积累过程，对于 AML 和 MDS 预后评估需要检测多基因突变。为了适应高通量和高敏感性的要求，二代测序(NGS ) 应运而生。NGS 技术是对传统的一代测序技术的一次革命性改变，能够同时并行对几十万或几百万条较短 DNA 分子进行序列分析，NGS 不仅测序速度快，而且检测深度高于一代测序 100 倍以上，还可以相对定量。目前多中心实验室的评估表明，二代测序具 有高度一致性和可重复性，更重要的是目前 NGS 的检测成本已降低到可以用于常规临床检测。因 此，目前 NGS 在 AML 和 MDS 中的突变监测已成为研究热点。

1.

病例资料

标本取自 2015 年 8 月至 2016 年 6 月在哈尔滨血液病肿瘤研究所诊治的 68 例 AML 患者和 57 例 MDS 患者。68 例 AML( 30 例 M2，4 例 M4，8 例 M5，26 例未分型) 患者中男 37 例，女 31 例，中位年龄 42 岁。57 例MDS( 6 例MDS-ＲAS，9 例MDS-ＲAEB，42 例未分型) 患者中男 34 例，女 23 例，中位年龄 51 岁。所有患者均经骨髓细胞学、免疫表型、染色体和融合基 因检测，符合国内现行白血病和 MDS 诊断及分型标准。

标本采集和 DNA 提取

常规抽取患者髂骨或腰椎骨髓2－4ml，EDTA 抗凝，以人淋巴细胞分离液收集骨髓单个核细胞，生理盐水洗涤单个核细胞，然后根据天根生化科技( 北京) 有限公司的 DNA 提取试剂盒说明书提取 DNA。

基因突变检测

取1 μg 的DNA，采用AML / MDS 二代测序芯片对基因进行突变检测，检测基因包括 FLT3，NPM1，C-KIT，CEBPA，DNMT3A， IDH1，IDH2，TET2，EZH2，AML1，ASXL1，PHF6， TP53，SF3B1，SＲSF2，U2AF1，ZＲSＲ2，NＲAS，CBL，SETBP1，ETV6，JAK2。

采用 SPSS 17. 0 软件进行统计学分析，一代测序和二代测序在 AML 和 MDS 患者中的基因突变阳性率采用卡方检验，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

二代测序与一代测序基因突变率比较

本研究中选取的基因突变是体细胞获得性的再现性突变，且均是杂合性突变，未见纯合性突变。比较了二代测序和一代测序中 AML 和 MDS共有的 5个基因(SF3B1，TP53，DNMT3A，C-KIT 和 TET2) 突变，虽然 5 个基因的检测区域相同，由于二代测序的高度敏感性，各基因突变阳性率均有所提高。最明显的是 TP53 基因，一代测序中无论 AML 还是 MDS 均未发现突变，而二代测序中TP53阳性率在AML和MDS中分别为 4. 4% 和 5.3% ; 其次是 C-KIT 基因，一代测序时 AML 中阳性率仅为 2.1% ，而二代测序时阳性率为 7.4% 。但由于样本数太少，虽然各基因阳性率均有所提高，卡方检验结果却只有 TET2 在 MDS 患者中的阳性率达显著性差异( 表 1) 。

AML 患者各基因突变及其特点

约 82.4% ( 56 /68) AML 标本至少检测到1 个突变基因，22 个基因中 TET2 阳性率最高为( 55.9% ) ，其次是CEBPA (11.8%) ，其中 DNMT3A、C-KIT、FLT3-ITD 和 NＲAS 基因阳性率均为 7.4% ，阳性率较低的基因为SRSF2 (5.9%)、TP53(4.4%) 、CBL(4.4%)和ASXL1 ( 2. 9% ) ，IDH1、IDH2 和NPM1 基因，均发现 1 例突变阳性患者，在其余基因未发现阳性患者。

突变率较高的基因中除了 TP53、CEBPA 无特定突变位点外，其他基因均有特定突变位点，其中TET2 主要为 P29Ｒ、I1762V 和 V218M 突变，其阳性率分别为55.3%(21/38) 、47. 4% (18 /38 ) 和13. 2% (5 /38) 。DNMT3A 主要为 F868V 突变，阳性率为 60% (3 /5 ) ，而常见报道 AML 中 DNMT3A 的Ｒ882C 突变率仅为 20% (1 /5 ) ，有意义的是 80% (4/5) 的 DNMT3A 阳性患者为 M2。与 DNMT3A 相似的是 C-KIT 基因，该基因突变阳性者全为 M2 患者(5/5) ，且 80% 的突变位点为 D816Y。FLT3 基因80% ( 4/5 ) 为 ITD 突变，NＲAS 基因 60% ( 3/5 ) 为G12，40%( 2/5) 为G13 突变，SＲSF2 基因 100% ( 4 /4) 为 P95H 突变。

MDS 患者各基因突变及其特点

约76. 4% ( 44 /57 ) 的标本至少检测到1个基因突变，在所有基因中TET2 阳性率最高为 56.1% ( 32 / 57) ，其次是 U2AF1 和SＲSF2 基因，两者阳性率均为10.5%( 6/57 ) ，其中 SF3B1、DNMT3A、TP53 和CEBPA 基因阳性率均为 5. 3% ( 3 /57) ，在其余基因未发现突变阳性患者。

与 AML 相似，除 TP53 和 CEBPA 外，其他基因均有特定突变位点，其中 TET2 主要为 P29R 和I1762V 突变，其阳性率分别为 56.3% ( 18 /32 ) 和 50.0% ( 16 /32) 。U2AF1 和 SRSF2 基因主要为单一氨基酸突变，其中 U2AF1为S34位点( 83..3% 为 S34F，16.7% 为 S34Y) ，SＲSF2 为 P95 位点( 33.3%为 P95H，50% 为 P95T，16.7%为P95R)。SF3B1基因 66.7% 为 K700E 突变，与AML相似，DNMT3A基因 66.7% 突变为 F868V。

突变基因作为 MRD 监测及复发预测

在上述患者中均有 5 例 AML 和 MDS 患者进行了连续检测，所有 AML 患者均发生 TET2 突变并分别伴C-KIT、FLT3-ITD 和 CEBPA 基因突变; 5 例患者缓解时与初发时相比 TET2 基因突变率无明显变化，而其余 3 个基因突变均转为阴性，其中 1 个患者初发时 CEBPA 的 2 个突变位点缓解时也均转阴。而在复检的 5 例 MDS 患者中，包括 TET2 在内所有基因突变率均未发生明显变化，其中 3 例 MDS 患者发生疾病进展，无论是 MDS-RAS 进展为 MDS-RAEB 还是 MDS进展为AML，均出现了新的基因突变，并且疾病进展后再次缓解时与进展时相比基因突变及其 突变率均无明显变化( 表 2) 。

3.讨论

二代测序又称为高通量测序或深度测序，1 次可对几十万到几百万条 DNA 片段进行序列测定和分析， 它不仅具有高通量性，而且比一代测序更为敏感，并 且还可以相对定量。因此，二代测序的产生是肿瘤 发病机制、预后评估及诊断治疗领域中里程碑式的 进步，大大加快了科研向临床转化的进程，尤其是特 定目的基因外显子测序对于 AML 和 MDS 相关基因突变检测意义重大。AML 和 MDS 的发生是一个多步骤多基因参与的过程，需要同时检测与 AML 和MDS 发生发展相关的几十个基因突变，有的基因需检测的片段也较多，并且有的突变位点突变率较低， 这是一代测序很难完成的。如本研究中二代测 序同时检测了22 个相关基因的突变状态，相同基因阳性率与一代测序相比，各基因阳性率均有所提高， 就连阳性率较高的 TET2 基因也由一代的41.7%( AML)和32%( MDS) 分别提高到 55. 9% 和 56.1% 。TP53 基因则更明显，一代测序时 98 例标本中均未检测到突变，但二代测序时 125 例标本中就检测到 6 例突变。敏感性提高的原因一方面是因为二代测序的敏感性更高，可以检测到 0. 1% 的突变，如TP53 基因有可能其突变率较低( 如小于 20% ) ，即使患者存在突变但由于一代测序受限于其较低敏感性也未能检测到突变，另一方面可能是二代测序覆盖区域广，能检测到的突变位点也较多。

血液系统恶性肿瘤如 AML 和 MDS 都是具有高度异质性的多基因疾病，其克隆演变是一个顺序性、 多基因突变的积累过程，即使细胞核型正常的中危患者由于其突变基因不同预后也不同，如中危组中伴 TP53 基因突变的正常核型 AML 患者疗效较差， 其预后分型为高危。因此，AML 和 MDS 预后评估时还需纳入多基因突变结果，应运而生的高通量、高 敏感性的二代测序将使其预后分层更准确，相比荧光定量 PCＲ 等方法也能更明确地了解基因突变类型。虽然许多基因都参与了 AML 和 MDS 的 发生发展，但每种疾病均有其特定的基因突变谱，即各基因的突变率不同，如本文中TET2 基因突变率在 AML 和 MDS 中均超过 50% ，远高于 Ohgami等和Haferlach等报道的该基因在 AML 和MDS 中的突变率，这可能是由于国内外患者群差异所致，也可能是检测的患者标本疾病亚型不同。除TET2 外，AML 中突变率较高的基因为CEBPA、DNMT3A、C-KIT等，而MDS中突变率较高的基因为SRSF2 和 U2AF1，DNMT3A 和 C-KIT 基因突变多发生在 M2 中，说明基因突变率与疾病类型相关。并且 DNMT3A 突变位点60% 为F868V，20% 为 R882，与 Jeziskova 等报道的 DNMT3A 主要为 R882 突变不符，这一差异有可能是国内外患者群差异导致也有可能是我们检测的病例数太少。

诱导化疗后骨髓相中幼稚细胞百分率一直是评 价 AML 临床疗效的指标，但从形态学上精确的统计原始细胞增加数比较困难，并且骨髓细胞有时还有生理性的增加。因此近年来多参数的流式细胞术和 荧光定量 PCR( qPCR) 方法已被用来监测疾病负荷而进行针对性的治疗，但通常 AML 中这种高灵敏度的 qPCR 方法检测大多依赖 ＲNA 水平的定量，并且限制在有特定基因重排的 AML 患者中。由于二代测序可以对基因突变进行定量检测，可在 100 000 个正常细胞中检测到 1 个突变细胞，对 20 例外周血标本对照检测时发现 NGS 假阳性的读取率仅为0.00045% ，表明该方法监测肿瘤负荷时具有足够的特异性和灵敏度。因此，对于大部分无特定融合 基因的 AML 患者我们可尝试应用基因突变率进行微小残留病监测。如 Klco 等报道，成功诱导化疗后 30 天 AML 患者基因突变清除者的 EFS 和 OS 明显高于未清除者。在本研究中 5 例 AML 患者 CR 与初发相比CEBPA、C-KIT 和FLT3 基因突变均被清除，说明 AML 中这些基因可能与 AML 疾病进展相关，其突变率可作为 MRD 来评估患者预后和治疗效果。虽然有较多文献报道 TET2 突变阳性的 AML 患者预后不良，但本研究病例中伴随的 TET2 突变率均无显著性变化，说明 TET2 可能仅能用于预后评估但不适合作为 MRD 的监测指标，或者TET2 基因片段较长，虽然我们检测到的位点突变率较高，但在中国 AML 人群中仅为 SNP 位点并不是致病位点。

在复检的 5 例 MDS 患者中，缓解与初发时相比，所有基因突变率均无明显变化，即使在 MDS 转变成 AML 缓解后( 如表 2 中 MDS-AML2) 基因突变率也无明显变化，说明 MDS 中基因突变不能作为MRD 指标，并且 MDS 转为 AML 后其遗传突变也维持 MDS 的特征。有意义的是，2 例 MDS 患者发生疾病进展时( 一例转变成 AML，一例由 MDS-RAS 进展为 MDS-RAEB ) 均出现了新的基因突变，说明MDS 中基因突变可能与其疾病进展相关，可提前预测复发。

总之，通过对患者异常基因突变进行二代测序检测，我们不但可以协助诊断，还可以对患者进行危 险度分层，评估患者的预后。AML 中基因突变率还可以作为 MRD 指标评估效果及调整治疗方案，MDS中根据基因突变谱差异还可以进行复发预测。然而，众多基因中的突变位点，哪一个起主要作用及基因突变负荷多少才有意义仍需要我们进一步研究。