撰文丨然自得 博士
臨床上通常以形態學特徵、組織背景以及標誌基因表達情況來鑑定癌細胞。隨著單細胞轉錄組測序的發展，人們得以獲取單個細胞中廣譜且量化的信使RNA（messenger RNA，mRNA）信息，進而推斷腫瘤細胞的來源及其惡性化過程的轉錄軌跡，為癌細胞的鑑定工作提供了新的策略。
腎癌是一種常見的惡性腫瘤，位列癌症相關死亡率排名的前十位。腎癌有十餘種亞型，主要包括腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC，約佔超過90%的腎癌）、移行細胞癌（transitional cell carcinoma）、腎母細胞瘤（Wilms’ tumor）等【1,2】。由於缺乏相關研究，人們對於腎癌的瞭解較少，其檢測及治療與其他癌種相比也較為困難。因此，解析複雜的腎癌組織內部成分有助於研究其發生機制、細胞類群及功能狀態，具有重要的臨床指導意義。
前不久，Science雜誌在線發表了英國劍橋大學韋爾科姆基金會桑格學院研究所（Wellcome Sanger Institute）一篇題為Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors的文章，研究人員通過分析72501個腎組織細胞的轉錄組特徵，並結合對應腎癌組織的全基因組測序數據，鑑別了正常的腎細胞以及癌變的腎細胞。
該研究共涵蓋3例腎母細胞瘤，3例腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC），1例乳頭狀腎細胞癌（papillary renal cell carcinoma，pRCC），以及健康的2例胚胎、3例幼兒、2例青少年、5例成人腎臟樣本和4例輸尿管樣本。研究發現，兒童腎母細胞瘤中癌細胞的轉錄組特徵與特定的胚胎細胞類群接近，因而為腎母細胞瘤細胞屬於異常胚胎細胞這一假說提供了證據。
在成人腎細胞癌中，癌細胞類群呈現出一類近曲小管細胞（proximal convoluted tubular cell）的特徵。進一步對腫瘤組分中癌相關正常組織細胞類群的分析，描繪了一個複雜的血管內皮生長因子（tumor endothelial growth factor，VEGF）在腫瘤內部的信號迴路。該研究揭示了精確的人類腎癌各組分及對應的細胞特徵。
文章的四位通訊作者（左起）：Sam Behjati，Menna Clatworthy，Sarah A. Teichmann，Muzlifah Haniff。
研究人員首先分別對所有細胞進行了聚類分析，基於所得不同類群的正常成熟細胞和胚胎細胞的轉錄組特徵構建了基準圖，描繪了包含腎單元各區域上皮細胞、近端小管細胞、成纖維細胞、肌纖維母細胞和血管內皮細胞的成熟腎臟圖譜，以及包含發育中的腎小管細胞、成纖維細胞、肌纖維母細胞、血管內皮細胞和神經節細胞的胚胎腎臟圖譜，並進一步鑑定出與腎小管發育過程相關的轉錄因子。
值得一提的是，在比較癌組織細胞類群與正常腎組織細胞類群相似性時，為了減少由於癌組織細胞可塑性帶來的影響，研究人員建立了一種基於全基因組測序所得體細胞拷貝數變化的癌組織細胞分型方法。通過相似性分析及基因分型，研究人員得以比較癌組織內部的細胞類群與正常組織類群的相似性關係，從而推測癌細胞潛在的發生發育路徑。
腎母細胞瘤是一種多發於兒童的實體瘤【3】，該研究發現腎腫瘤中存在與特定發育階段的正常胚胎腎臟細胞類似的兩群細胞——輸尿管芽細胞（ureteric bud，UB）和原始囊泡細胞（primitive vesicle，PV）。在胚胎腎臟發育成熟過程中，偶爾出現的胚胎組織殘留結構被稱為腎源性殘餘（nephrogenic rest），該結構被認為是腎母細胞瘤的前期病變【4】。研究人員在其中一個病人的臨床樣本中發現了葉周型腎源性殘餘的存在，且其內部細胞群特徵同樣與UB細胞或PV細胞類似，暗示著胚胎腎單位在早期就已獲得向不同細胞狀態轉化的潛力，或者在腎母細胞瘤的發展過程中並未喪失這一潛力。
腎母細胞瘤細胞類群、癌症相關正常細胞類群與成熟腎臟基準圖的相關性分析：其中2群癌細胞分別呈現出UB和PV細胞的特徵
進一步的分析發現，腎母細胞瘤細胞在擬時間上呈現出兩條以UB細胞狀態為起點的變化路徑：一支代表了腎源性殘餘的發育過程，另一支代表了腎母細胞瘤的發育過程。這就暗示了在正常腎發生過程中出現的腎母細胞瘤細胞之間存在發育關係，
揭示了腎母細胞瘤細胞的可塑性與其胚胎特徵，同時從轉錄組層面定義了其發育狀態和轉換軌跡。
腎母細胞瘤及腎源性殘餘細胞的擬時間軌跡
接下來，該研究對腎透明細胞癌和乳頭狀腎細胞癌進行了深入解析。與正常細胞類群特徵基準圖對比發現，大多數癌細胞類群均呈現出一個近曲小管細胞類群 （PT1）的特徵，暗示了腎細胞癌中存在一個超越了腫瘤細胞內部及不同腫瘤之間差異的細胞狀態。發炎的腎組織中存在更多的PT1細胞，然而這群細胞的功能卻尚不清楚【5】。進一步對1019個腎癌及正常腎組織轉錄組數據的分析證實了PT1細胞是與腎透明細胞癌細胞最為接近的正常細胞類型，而腎透明細胞癌和乳頭狀腎細胞癌所呈現出的PT1細胞特徵則暗示了這兩支不同分化命運的癌細胞可能具有相同的來源。
腫瘤細胞類群、癌症相關正常細胞類群與成熟腎臟基準圖的相關性分析：其中6個腎透明細胞癌類群和1個乳頭狀腎細胞癌類群呈現出PT1細胞特徵
最後，該研究解析了腫瘤微環境中的正常細胞類群：免疫細胞、成纖維細胞、肌纖維母細胞和血管內皮細胞，並分析了血管內皮生長因子（tumor endothelial growth factor，VEGF）信號通路的關鍵基因在各細胞類群中的表達情況（VEGF是腎細胞癌治療的一個靶點【6,7】）。他們發現，腫瘤浸潤巨噬細胞（macrophage）可作為除腫瘤細胞外的另一VEGFA來源。其他類群如直血管升支（ascending vasa recta）細胞、內皮細胞也表達不同的VEGF通路基因。
VEGF通路基因在各類群的表達情況
通過鑑定腎癌細胞與特定正常細胞類群之間的關係，該研究將人們對腎癌的認知從簡單的胚胎屬性和解剖學分區推進到更為精準的細胞層面乃至分子層面，描繪了腎母細胞瘤伴隨胚胎腎發生過程的惡性轉化，為人類癌症細胞的鑑定工作提供了新的策略。
值得一提的是，Cancer Discovery雜誌編輯部發表短文對上述工作進行了介紹，特別提到目前的單細胞RNA-Seq技術為腫瘤細胞的分子分型提供了很好的策略（Single-cell RNA-seq provides a strategy for determining the molecular identity of human cancer cells）。
參考文獻
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2. Nabi, S., Kessler, E. R., Bernard, B., Flaig, T. W. & Lam, E. T. Renal cell carcinoma: a review of biology and pathophysiology. F1000Research 7, (2018).
3. Coppes, M. J., Haber, D. A. & Grundy, P. E. Genetic Events in the Development of Wilms’ Tumor. N. Engl. J. Med. 331, 586–590 (1994).
4. Lonergan, G. J., Martínez-León, M. I., Agrons, G. A., Montemarano, H. & Suarez, E. S. Nephrogenic rests, nephroblastomatosis, and associated lesions of the kidney. RadioGraphics 18, 947–968 (1998).
5. Seron, D., Cameron, J. S. & Haskard, D. O. Expression of VCAM-1 in the Normal and Diseased Kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 6, 917–922 (1991).
6. Ljungberg, B. et al. EAU Guidelines on Renal Cell Carcinoma: 2014 Update. Eur. Urol. 67, 913–924 (2015).
7. Fernández-Pello, S. et al. A Systematic Review and Meta-analysis Comparing the Effectiveness and Adverse Effects of Different Systemic Treatments for Non-clear Cell Renal Cell Carcinoma. Eur. Urol. 71, 426–436 (2017).
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