抗戰時，中共領導的正規部隊有11個師，其中八路軍4個師（115師、120師、129師和楊成武獨立師），新四軍有7個師，總共11個師。但是，在11對師長和政委搭檔中，只有一對是男女搭檔，那就新四軍第5師。其中，師長兼政委為李先念，副政委為陳少敏。
抗戰全面爆發後，陳少敏和李先念，本來是各帶一支部隊。1939年6月，他們在京山縣養馬畈大山頭召開會議，把兩支部隊整編為新四軍鄂豫獨立遊擊支隊，李先念任司令員，陳少敏為政委，隨後，獨立游擊隊又擴編為新四軍鄂豫挺進縱隊，還是一個是司令員，一個是政委。作為政委，陳少敏雖然是一個女的，但是能文能武，合兵後還是經常獨自帶一支部隊與日軍和頑軍周旋、作戰。
一次，陳少敏率領挺進縱隊第一支隊由平漢線路東向略西挺進。夜間經過東雙河時，由於軍馬受驚突然嘶叫，被河邊的日軍崗哨發覺，開槍射擊，附近車站炮樓內的日兵拼命打照明彈、放槍。陳少敏十分鎮靜，下令部隊做好戰鬥準備，一邊渡河，她說：“日軍在國軍前逞兇，但害怕我新四軍，不敢同我們夜戰，所以躲在烏龜殼亂放槍，不敢出來。我們先不理他，繼續過河。”部隊繼續西行，日軍等了一會見沒動靜，100多人乘輕便火車向南探索前進。陳少敏下令部隊隱蔽在鐵路兩旁的山上，準備待敵人火車回返時予以痛殲，天亮時，當輕便火車返回時進入埋伏地段時，陳少敏一聲令下，官兵一躍而上，一陣手榴彈，打得敵人猝不及防，100多名鬼子兵全部消滅。
在鄂豫邊區，偽軍也是一大禍害。其中，李又唐部仗著2000多人槍仗勢獨霸一方，殘害百姓。一次，陳少敏指揮新四軍打另一支日軍時，李部趁機攻擊。陳少敏於是決定消滅他。一日，她率領1、3團從京山大山頭出發，直撲李又唐偽軍巢穴。大霧迷漫。新四軍激戰兩天一夜，李又唐嚇得丟下部隊獨自逃跑，七個大隊偽軍全部被殲，而新四軍無一傷亡。陳少敏是新四軍出了大名的女將，日、偽軍聞風喪膽，國民黨對她也是恨之入骨。
1940年初，國民黨第五戰區前敵指揮部開了一個軍事會議，要求新四軍擔負保護京漢鐵路的任務，還劃定了一段區域，去“協同收復國土”。陳少敏立即洞察出對方的陰謀，說：“他們想要我們把主力集中到鐵路線上，好來個一網打盡。”
於是，她決定將主力向遠離鐵路線的應山一帶轉移，派孔化率一箇中隊到國民黨指定的地區，相機行事。果不出陳少敏所料，當孔化率隊來到鐵路線上時，國民黨頑軍立即以預先設好的袋形包圍陣勢，向他們發起猛烈進攻。陳少敏接到報告，立即率領主力回援，對頑軍堅決還擊。結果，頑軍總指揮包剛，被陳少敏指揮的新四軍擊斃。戰後，國民黨陰謀敗露，卻不敢公佈實情，只好說這是一場“誤會”。
皖南事變後，鄂豫挺進縱隊正式改編為新四軍第5師，李先念任師長兼政委，陳少敏以黨委書記身份再兼任副政委，仍然為搭檔。兩年後，鄭位三從別處調來擔任5師政委，陳少敏於是轉而主要負責區黨委和地方政權建設。但是，一旦戰情緊張，她又披甲上陣。後來，邊區生產了一種“女將軍”牌香菸，上面的女將軍躍馬舉槍，不少人說她就是陳少敏。
陳少敏是中共長期直接領導武裝鬥爭的少有的女領導幹部，一生傳奇，被稱為“女中豪傑”。
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