營養性佝僂病的診斷要依靠病史、體格檢查、生化檢測和X線等全面評價。僅憑生化檢測指標既不能診斷營養性佝僂病，也不能鑑別營養性佝僂病的原發因素是維生素D缺乏還是膳食鈣缺乏。
雖然檢測25(OH)D是評估維生素D狀況的最佳方法，可用於評價兒童是否存在維生素D缺乏，而且臨床上也是根據兒童血清25(OH)D水平把維生素D狀況分為4個等級 --- 充足（血清25(OH)D>50～250 nmol/L）、不足（30～50 nmol/L）、缺乏（<30 nmol/L）和中毒（>250 nmol/L），但是單一時間節點的血清25(OH)D水平並不能完全反映機體一段時間內維生素D狀況，25(OH)D濃度>30 nmol/L的兒童中也有罹患佝僂病的報告。所以不推薦對健康兒童進行常規25(OH)D檢測。
目前尚無反映鈣攝入量狀況的可靠的生物標誌物，血鈣水平並不能反映體內鈣的真實狀況。
首先血鈣(包括結合鈣和遊離鈣)只佔人體鈣的0.02%，99%的鈣貯存在骨骼中，兩者之間存在動態平衡，當食物中的鈣攝入不足時，人體可以從骨骼中動員鈣進入血液以維持血鈣的穩定。
再者，血漿中的鈣約一半與血漿蛋白結合，另一半為離子化的遊離鈣，測定血漿總鈣量不能反映遊離鈣的水平；遊離鈣的重要功能之一就是維持神經肌肉的興奮性，包括心肌和骨骼肌，所以在生理情況下機體可以通過一系列的調節機制維持遊離鈣水平的穩定，以維持生命活動得以正常進行。
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