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毒力因子鉴定是病原菌致病机理研究的一个重要内容。目前广为应用的是转座子插入突变筛选（Tn-seq: Transposon insertion sequencing），然而这一技术手段有明显的局限性：不能研究必需基因（必需基因的插入突变是致死的）；并非所有的插入突变都能导致基因失活，因而要进行全基因组的研究需要过饱和的突变体库；技术上建库复杂，测序步骤繁琐，失败率高等。
病原菌致病机理研究中的另一个重要内容是感染过程中的瓶颈问题。细菌要成功侵染宿主需要一定的剂量，这是因为它们在侵染宿主的过程中需要突破一层层的屏障，在通过屏障时会不断有细菌被清除。这些屏障主要来自宿主方面的压力，比如营养限制，免疫响应等。就像攻城一样，单枪匹马无法成功，需要团体作战，作战过程中伤亡是不可避免的。通俗来讲，突破屏障的过程就像菌群通过一个瓶口，瓶口的最窄处决定了能通过的最小菌群大小。而这个最小菌群就是能最后在宿主内存活并造成最终感染的关键。实际上，往往是由于少数几个，甚至可能仅仅是一两个细菌的存活和后续的增殖造成最终的感染。研究病原菌感染过程中的瓶颈，例如鉴定出那些能增强瓶颈效应的免疫应答，可能会为抗感染治疗提供新的途径。
2020年10月28日，来自瑞士的Jan-Willem Veening课题组（第一作者为刘雪博士，共一作包括来自加州大学圣克鲁斯分校的助理教授Jacqueline Kimmey和来自法国巴斯德研究所的Laura Matarazzo）在Cell Host & Microbe上发表了题为“Exploration of bacterial bottlenecks and Streptococcus pneumoniae pathogenesis by CRISPRi-seq” 的文章。该研究讲述了一种新的高通量研究病原菌致病机理的方法: CRISPRi-seq。CRISPR interference (CRISPRi)是一种基于CRISPR 系统利用dCas9(失活的Cas9,只有结合活性而没有切割DNA活性)对基因敲低（knockdown）的技术【1,2】。该方法是将CRISPRi技术巧妙地和二代测序技术illumina sequencing 结合，可以高通量的筛选毒力因子，并且高精度的定量细菌感染过程中的瓶颈大小。
该技术的亮点如下：
1. 既适应于动物体内又适应于体外的可诱导的CRISPRi系统 (图一)。这是首次报导的在细菌中能应用于动物体内诱导的CRISPRi系统。该系统可以用多四环素在体外实现强度可调的诱导，在体内可以有效的诱导CRISPRi系统敲低细菌中的靶标基因，从而适用于病原菌的致病机理研究。
图一. 在肺炎链球菌中可以体内体外诱导的CRISPRi系统。
2. 该技术将CRISPRi和illumina sequencing巧妙结合。在设计sgRNA的时候，引入illumina amplicon的特征序列，可以通过一步PCR迅速建库（图二）。建库简单，成本极低，稳定性高，可以通量化。
图二. CRISPRi-seq的过程示意图（以在体外的C+Y培养基上利用CRISPRi-seq对全基因组基因的重要性评价为例）。
3. 该技术既可以用于细菌的毒力因子的筛选，又可以用于定量细菌侵染过程中的瓶颈大小（图三）。这是因为该CRISPRi诱导系统的调控非常严紧，在没有诱导剂的情况下，没有检测到knockdown活性。因而sgRNA可以作为中性barcode用于瓶颈大小的定量计算。
图三. CRISPRi-seq用于筛选毒力因子和定量细菌感染的瓶颈大小。
肺炎链球菌是一种重要的人类条件致病菌。它在正常情况下定植于人类的上呼吸道，不造成疾病。大约有27%-65%的儿童和<10%的成年人是该菌的正常携带者。当人的免疫功能低下时，该菌可以侵染肺部，血液，甚至大脑，从而引起肺炎、菌血症、脑膜炎等严重感染。老人，小孩，以及免疫系统受损人群均易感，该菌造成的感染每年在世界范围内会造成超过百万人口的死亡，严重威胁着人类的健康。更可怕的是，肺炎链球菌和流感病毒的共感染会进一步加强前者的致病性和致死性。比如，1918年肆虐全球的西班牙大流感，造成了千万人口的死亡，是人类史上最致命的一次大流行。近年来，微生物学家和流行病学家对1918年的西班牙大流感的研究发现，超过95%的严重感染和死亡是由细菌共感染造成的，而其中绝大多数由肺炎链球菌的共感染造成【3】。2019年末爆发的新冠肺炎席卷全球，近期也有研究证实继发性的细菌共感染是造成该疾病恶化的一个重要原因【4】。目前科学家对肺炎链球菌和流感病毒共感染有一定的认识，比如流感病毒可以破坏呼吸系统抗感染的天然屏障，从而促进细菌共感染的发生；细菌表达的部分毒力因子可以利用病毒感染后肺的生理和免疫变化来增强其侵染能力；病毒和细菌表达各自的毒力因子，协同抑制宿主的免疫应答等。然而，具体有哪些毒力因子起作用，它们是怎么起作用的并不清楚。
针对这些问题，作者在肺炎链球菌模式菌株D39V中构建了一个含有1499个sgRNA的CRISPRi库，该库基本上靶标到了D39V菌株的所有基因。然后作者用CRISPRi-seq，对目前肺炎链球菌领域里常用的小鼠肺炎模型进行了研究，发现该模型中细菌侵染过程存在着显著的瓶颈效应：起始构建侵染模型时用的菌量是108CFU，侵染过程中有的小鼠体内的菌量可以降到25个，然而这仅仅25个存活下来的菌便可以进一步繁殖最后造成肺炎以及进一步的菌血症。由于sgRNA可以作为一个细菌的身份标记，因而通过追踪sgRNA在库中的丰度，可以一定程度上追踪单个细菌的行为。该研究发现，在单细胞水平上，即使是用纯系小鼠作为宿主，宿主之间仍然存在着很大的个体差异。这样的观察显示了单细胞水平进行肺炎链球菌致病性研究的必要性。肺炎链球菌是一种人类专属的条件致病菌，小鼠并不是其天然宿主，因此在小鼠模型中显著的瓶颈效应是否在人类感染过程中也存在，是后续要研究的一个重要问题。
进一步，作者利用CRISPRi-seq技术对小鼠中的(肺炎链球菌-流感病毒)共感染模型进行了研究。一方面作者筛选得到了多个已知和未知的肺炎链球菌毒力因子，为肺炎链球菌的治疗提供了潜在的靶标；另一方面，作者发现某些体外培养基中的必需基因，在宿主体内反而是非必需基因。由于之前缺乏在体内对必需基因进行研究的工具，这类基因有可能会被误作有潜力的靶标。作者的这些发现有助于科学家更加合理地选择有效治疗靶标。
总之，在该研究中，作者主要将CRISPRi-seq用于肺炎链球菌的小鼠肺炎模型和共感染模的型究。但这样的研究范式完全可以扩展到更多的病原菌中，针对更多种的动物模型进行致病机制和感染瓶颈研究，为病原菌的研究提供了新的思路和方法。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.10.001
参考文献
1.Bikard, D. et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 41, 7429–7437 (2013).
2.Qi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173–1183 (2013).
3.McCullers, J. A. The co-pathogenesis of influenza viruses with bacteria in the lung. Nat. Rev. Microbiol. 12, 252–262 (2014).
4.Vaillancourt, M. & Jorth, P. The Unrecognized Threat of Secondary Bacterial Infections with COVID-19.mBio 11, (2020).
