點評 | 葉幼瓊、蘇冰 （上海交通大學醫學院，上海市免疫學研究所）
免疫檢查點抑制劑（Immune checkpoint blockade, ICB）能夠破壞腫瘤細胞對免疫監視的逃逸，極大地改變腫瘤病人的治療模式 【1】。儘管基於免疫檢查點開發的抑制劑藥物，如PD-1抗體，在多種腫瘤治療中取得良好療效，然而在臨床實驗中仍有部分患者無法獲益，如基因組微衛星穩定（Microsatellite stable, MSS）的結直腸癌病人【1-3】。
之前，張澤民團隊與合作者開發了STARTRAC生物信息學方法，首次對結直腸癌單個浸潤T淋巴細胞的特徵及其動態變化進行了系統性地刻畫，發現並解析了基因組微衛星穩定和不穩定病人的T細胞差異【4】。相關工作已於2018年10月29日，以"Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer"為題發表在Nature 雜誌上（詳見BioArt報道：Nature | 張澤民組開發新方法解釋結直腸癌T細胞動態變化）。
在腫瘤微環境中，除淋巴細胞外，髓系免疫細胞（Myeloid cell）作為主要的抗原提呈細胞在腫瘤免疫中同樣發揮重要的功能。多項靶向髓系免疫細胞如腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-associated macrophage, TAM）和樹突狀細胞（Dendritic cell, DC ）的治療策略已進入臨床前試驗。然而這些細胞在結直腸癌腫瘤微環境中的特徵，其與T細胞等其他細胞的相互作用關係，以及其靶向藥物的作用機理尚未得到全面闡釋。
2020年4月16日，北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）、生命科學學院、北京未來基因診斷高精尖創新中心（ICG）、北大-清華生命科學聯合中心（CLS）張澤民課題組聯合美國安進（Amgen）公司Jackon G. Egen、Yu Xin團隊和北京大學人民醫院申佔龍課題組在Cell上以Article形式發表了題為Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer的研究論文。該研究在單細胞水平對結直腸癌患者的腫瘤微環境，特別是浸潤髓系細胞類群首次進行了系統性的刻畫，分析了TAM和DC細胞的類群特徵、譜系發育及其與T細胞和其他細胞間相互作用關係。基於以上結果，研究團隊分別對接受anti-CSF1R抑制劑和anti-CD40激動劑的小鼠模型進行單細胞測序，揭示了這兩種靶向髓系細胞的免疫治療策略潛在的作用機理。此項國際領先的開創性工作，建立了結合腫瘤患者及小鼠模型的單細胞轉錄組來研究腫瘤免疫治療的範例，可為人們研究其他疾病中免疫細胞以及開發新的治療方案提供思路。
1. 結直腸癌腫瘤中浸潤著兩群狀態迥異的巨噬細胞
研究人員首先使用10x及Smart-seq2兩種技術對從結直腸癌患者中收集的免疫和非免疫細胞進行單細胞轉錄組測序，從中鑑定出包括T細胞、B細胞、先天性淋巴細胞（Innate lymphoid cell, ILC）、髓系細胞、上皮細胞、成纖維細胞等主要細胞類群及下屬的40個CD45+的免疫細胞類群和12個CD45-的非免疫細胞類群（圖1）。這些細胞亞群均具有特異性的表達特徵，且在不同組織中呈現出不同的細胞類型富集特徵。
圖1 整合結直腸癌患者和小鼠模型的單細胞轉錄組研究思路
在對各細胞類群進行功能註釋後，研究人員發現了一群富集於腫瘤內的FCN1+的單核細胞樣細胞，並推測其可能是TAM細胞發育的前體，這與近期在小鼠模型上研究腸道組織巨噬細胞的發育模式相吻合【5】。研究者還發現腫瘤相關巨噬細胞可以被分為SPP1+ TAM和C1QC+ TAM兩個具有不同發育來源 、不同細胞功能的細胞類群 （圖2）。應用RNA velocity等多種譜系發育分析推斷，C1QC+ TAM可能通過IL1B+的巨噬細胞發育而來，發揮細胞吞噬和抗原呈遞的功能；而SPP1+ TAM可能由NLRP3+的組織駐留巨噬細胞發育而來，發揮促血管生成及促進腫瘤轉移的功能。值得注意的是，結合腸炎病人及健康受試者的單細胞轉錄組數據【6】，研究人員首次分析發現，SPP1+ TAM特異性地富集在結直腸癌病人癌組織中，提示其可能在結直腸癌腫瘤發生發展中發揮重要作用。
圖2 結直腸癌浸潤細胞亞型相互作用網絡及髓系免疫細胞發育路徑
2.細胞間相互作用網絡提示結直腸癌髓系細胞的不同功能
為了研究結直腸癌內各細胞類群間的相互作用關係，研究人員利用Smart-seq2數據中各細胞類群的特徵基因集及TCGA中結直腸癌的bulk樣本，對各細胞類群間的相關性進行了 計算，並進而在癌旁組織和腫瘤內構建出"相關性關係網絡（Correlative network）"。從所構建的細胞間相互作用網絡中可以發現，TAM細胞和DC細胞與最多的細胞類群發生相互作用，構成了腫瘤內相互作用網絡的核心節點 （圖2）。值得注意的是，SPP1+ TAM和C1QC+ TAM也具有不同的細胞間作用關係，其中C1QC+ TAM主要與多種T細胞亞群發生相互作用，SPP1+ TAM則主要與腫瘤相關成纖維細胞（Cancer-associated fibroblast，CAF）發生相互作用，這也與上述這兩群細胞的主要功能相對應。兩群經典的DC細胞（Conventional DC，cDC）分別與不同類型的T細胞相互作用。該研究中新建立的細胞間相互作用分析網絡，有助於深入理解免疫細胞在腫瘤微環境中的不同功能。
3. 結直腸癌病人及小鼠腫瘤模型中浸潤的保守的免疫細胞亞型
基於以上針對結直腸癌腫瘤微環境的解析，研究人員接著利用小鼠腫瘤模型來研究靶向不同髓系細胞類群對抗腫瘤免疫反應造成的影響。anti-CSF1R抑制劑和anti-CD40激動劑是兩種已進入前臨床實驗階段的靶向髓系細胞的免疫治療策略【7,8】。其中CSF1R是促進髓系細胞增殖和分化的重要受體，CD40則是TNF受體家族的成員，在DC細胞和T細胞間的信號傳遞中發揮重要功能。研究者分別在MC38和Renca兩種小鼠模型中進行了anti-CD40與anti-CSF1R的治療，並獲得小鼠腫瘤浸潤免疫細胞單細胞轉錄組圖譜。與以上結直腸癌病人相比，DC和T細胞亞群在人和小鼠腫瘤中均有較高的一致性，如研究團隊此前發現的激活的LAMP3+ DC【9】和BHLHE40+ Th1-like 細胞【4】。而儘管巨噬細胞在人鼠間的異質性高於其他免疫細胞類群，但在小鼠腫瘤中也存在著與SPP1+ TAM和C1QC+ TAM相似的巨噬細胞亞群。
4. 單細胞轉錄組揭示anti-CSF1R抑制劑作用機制
研究人員進而對治療前後各細胞亞群比例及轉錄組的變化進行了分析，發現不同TAM細胞亞群對anti-CSF1R治療的敏感程度不同 （圖3）。Anti-CSF1R治療耐受的TAM細胞亞群與結直腸癌患者中的SPP1+ TAM具有較高的相似性，且會特異性地高表達與促血管生成相關的基因Vegfa以及參與免疫抑制過程的基因Cd274和Arg1。Anti-CSF1R阻斷型抗體會影響處在細胞週期中的巨噬細胞的增殖，並會特異性地刪除掉一定比例的具有C1QC+ TAM特徵的巨噬細胞，卻不會對具有SPP1+TAM特徵的巨噬細胞起到作用，提示anti-CSF1R治療後保留了在腫瘤中具有促進腫瘤血管生成的巨噬細胞。
該研究對anti-CSF1R抑制劑在大部分腫瘤患者中單藥療效較差的原因給出了一個機制性解釋。
圖 3 靶向巨噬細胞的anti-CSF1R抑制劑作用機制
5. 單細胞轉錄組揭示anti-CD40抑制劑作用機制
Anti-CD40激動劑治療可以使MC38小鼠的腫瘤體積縮小，且在與PD1阻斷劑聯合使用後還可以進一步抑制腫瘤的生長。然而，Anti-CD40激動劑治療的機制及細胞亞群的變化有待深入闡釋。本研究結合結直腸癌腫瘤患者和小鼠模型單細胞轉錄組分析發現，使用anti-CD40激動劑對MC38小鼠進行治療後的第2天，激活態的Ccl22+ cDC1細胞即迅速做出響應，細胞比例顯著增加。同時，在人鼠間保守的Bhlhe40+ Th1細胞比例也顯著上升 （圖4）。使用研究組此前開發的針對T細胞及其克隆性的分析方法STARTRAC【4】，研究人員發現anti-CD40激動劑治療後，Bhlhe40+ Th1細胞的克隆增生顯著增強。有意思的是，Bhlhe40+ Th1細胞所表達的Cd40lg轉錄本比例在治療後也有顯著上升，提示著anti-CD40激動劑治療可以通過促進Bhlhe40+ Th1細胞表達更多的Cd40lg來進一步增強腫瘤中Bhlhe40+Th1細胞與cDC1細胞間的相互作用。
相比CD4+ T細胞，CD8+ T細胞的響應速度則較慢，僅在治療後的第10天，可以觀察到Ccl5+ Tem細胞和Cxcr6+ Trm細胞比例的顯著增加，值得注意的是，Tem細胞在淋巴結和腫瘤間的遷移能力，及該群細胞與Trm細胞間的轉換能力也在治療後有著顯著的提升，提示此群Tem細胞可能與Stem-like T細胞相似，具有補充池（Pool）的功能。
圖4 靶向DC細胞的anti-CD40激動劑作用機制
該研究共同第一作者北京大學博士後張雷博士（同時為Nature工作共同第一作者）表示，"該工作對此前團隊針對結直腸癌腫瘤浸潤T細胞的研究有很好的延續性和前瞻性。此前研究中發現MSI結直腸癌病人中會富集一群BHLHE40+ Th1-like細胞，認為可能是該類型患者免疫治療響應更好的原因之一。而對於MSS病人的治療響應仍缺乏認識。在此項結合人鼠單細胞轉錄組的工作中，團隊首次發現靶向DC的治療策略anti-CD40可以顯著地提高此類細胞的水平，為MSS病人的臨床治療策略提供一定的指導。而靶向TAM的藥物機制的研究，將大大有助於後續靶點的挖掘及新的治療策略的開發。"
據悉，北大-清華生命科學聯合中心CLS博士後張雷博士，北京大學生命科學學院博士生李子逸、Amgen公司Katarzyna M. Skrzypczynska博士為該論文的並列第一作者，北京大學BIOPIC，北京大學生命科學學院，ICG和CLS張澤民教授、Amgen科學家Jackson G. Egen博士和
Xin Yu博士以及北京大學人民醫院胃腸外科申佔龍教授為該論文的共同通訊作者。Amgen炎症與腫瘤免疫部負責人歐陽文軍博士對此研究提供了寶貴建議。
部分研究人員，從左到右：任仙文，張啟明，李子逸（共同一作），歐陽文軍，高染染，張澤民（Lead通訊），張雷（共同一作），申佔龍（共同通訊），房巧，胡學達
專家點評
葉幼瓊、蘇冰（上海交通大學醫學院，上海市免疫學研究所）
腫瘤免疫療法，例如免疫檢查點阻斷療法（Immune checkpoint blockade，ICB），使得實體瘤治療有了革命性進展，顯著提高了許多惡性腫瘤患者的長期生存。但並不是所有腫瘤都對免疫療法有響應，目前只有少部分腫瘤病人具有顯著療效。因此臨床上迫切需要找到免疫治療響應與否的具體機制以及相應的生物標記，以提高免疫療法的效果。近年來，腫瘤微環境中的其它細胞成分，例如髓系細胞和其它免疫細胞亞群對腫瘤免疫治療效果的影響也逐漸受到人們重視。CSF1R阻斷療法在多個癌種中可以抑制腫瘤相關巨噬細胞而增加CD8/CD4 T細胞的比例。然而，由於我們對腫瘤微環境複雜性的不完全瞭解，髓系細胞靶定治療在腫瘤中的具體作用以及機制並沒有被完全理解。
目前單細胞測序技術已經成為探究細胞類群多樣性的有力手段，而不同的測序技術在細胞捕獲和基因捕獲效率上具有各自不同的優勢。SMART-seq2測序技術利用孔板對單個細胞進行實驗，通量雖相對較低，但每個細胞的基因捕獲率相對較高；而10x Genomics測序技術利用基於微滴包被的原理，可實現一次實驗獲得較多的細胞數量，有效降低了單細胞測序的實驗成本。二者結合可以充分發揮不同數據類型的優勢，獲得高分辨率的單細胞圖譜以研究腫瘤微環境在免疫治療中的作用。
4月16日，北京大學張澤民課題組結合SMART-seq2和10x Genomics兩種單細胞測序技術，於Cell在線發表了題為"Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer"的研究論文。通過分析腸癌病人的癌組織、癌旁組織和外周血的單細胞轉錄組，獲得高分辨率腸癌免疫細胞和非免疫細胞圖譜。並揭示了單核細胞/巨噬細胞的組織特異性，以及主要髓系細胞亞群在小鼠和人中的保守性。其中腫瘤相關巨噬細胞（TAM）主要來源於特異腫瘤浸潤的單核細胞樣細胞。區別於已知的M1和M2兩種巨噬細胞，TAM呈現兩種不同狀態，一種與炎症相關（C1QC+ TAM），更傾向於和髓系細胞或T細胞相互作用；另一種與腸癌轉移、血管生成相關（SPP1+ TAM），更傾向於與腫瘤相關成纖維細胞或內皮細胞相互作用。有意思的是，在小鼠實驗中，SPP1+ TAM對 CSF1R阻斷治療具有耐藥性，同時結腸癌病人中具有高浸潤SPP1+ TAM和低浸潤C1QC+ TAM都會有較差的預後，說明CSF1R單藥治療並不能完全消除TAM的促進腫瘤作用。其次作者確定腫瘤微環境中的三類樹突狀細胞（DC），包括LILRA4+ pDC、BATF3+ cDC1和CD1C+ cDC2，其中人的BATF3+ cDC1和小鼠的Ccl22+ cDC1/Clec9a+ cDC1保守，並意外發現BATF3+ cDC1同時和耗竭CD8 T細胞還有BHLHE40+ Th1樣細胞相互作用。在小鼠實驗中，作者發現CD40激動劑治療能增加Ccl22+ cDC1細胞亞群比例而對其它DC亞群影響很小，並能同時增加效應記憶T細胞數量而減少耗竭CD8 T細胞數量，誘導腫瘤中Bhlhe40+ Th1樣細胞的活化和擴增。此研究也從單細胞層面解析了CD40激動劑作用機制，為其和PD-1阻斷劑的聯合治療提供了理論基礎。
該工作全面地解析結腸癌的腫瘤微環境細胞圖譜，闡明細胞與細胞之間的相互作用，以髓系細胞為靶標的CSF1R阻斷劑和CD40激動劑的治療為例，揭示髓系細胞靶定治療的相關機制，對靶向腫瘤免疫微環境為基礎的腫瘤治療提供了更詳細的理論基礎，為今後靶定髓系細胞的精準治療提供助力，具有重要的臨床轉化意義。針對該工作中CSF1R阻斷劑治療的耐受性，未來研究需要尋找調控SPP1+ TAM的一系列因子，設計合適抑制劑，並通過聯合治療的方式達到完全消除TAM。同時需要推動基於髓系細胞的細胞療法的臨床實驗及相關生物學機制研究，以其提高免疫治療療效。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.048
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