他生于1840年，精通八国语言，复旦大学的创始人，北大校长蔡元培是他的弟子。
1900年，他卖点上海3000亩的田地，创办近代中国第一个私立大学“震旦学院”。
1905年，创办第二所大学，复旦大学。
1912年，辛亥革命胜利，中国民国成立，他任南京市首任市长。
抗日战争爆发后，马相伯已91岁高龄。他深感国难深重，为救亡呼号奔走，发表《为日祸告国人书》，主张“立息内争，共御外侮”。他亲自挥毫作榜书、对联义卖，共得10万元，全部捐给抗日部队。
他先后发起组织江苏国难会、不忍人会、中国国难救济会和全国各界救国会等爱国救亡团体，被公认为救国领袖、爱国老人。在他家里召开救国会第二次执委会时，他特地写了
“耻莫大于亡国，战虽死亦犹生”联语，与参加会议者共勉。
抗日战争前期，中国军队一直处于劣势，节节败退，他不断向后方转移，最后到了国外，最终在越南逝世。享年100岁。
病重之时，他忧国忧民之情更深，他说：“我只是一只狗，只会叫，叫了一百年，还没有把中国叫醒！”唯一让他感到欣慰的是在离世前几天，湘北大捷，他得知后，兴奋异常，夜不能寝！
1936年，沈钧儒、邹韬奋等“七君子”入狱，马相伯多方营救。次年七人获释后，前往看望马相伯，合影留念。沈钧儒在照片上题书“唯公马首是瞻。”
这张照片被收入包括中学教科书在内的大小历史著作，为很多中国人所熟悉。照片上，马相伯在众人的簇拥下，端坐正中，尽显人瑞之相。
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