眼看著基因編輯越來越火，而慢病毒基因表達系統是目前廣泛使用的基因編輯操作工具之一，因此慢病毒的包裝也慢慢越來越火，成為目前各大實驗室比較普遍的實驗之一，然而，有不少科研小夥伴表示，慢病毒的包裝實驗步驟實在是太複雜啦，傷不起!
下面，就為大家詳細介紹一下慢病毒包裝實驗的步驟以及滴度測定，供大家參考。
慢病毒基因表達系統由用於表達特定基因的目的質粒及病毒 gag/pol、Rev 和 VSVG 等組分的包裝質粒組成，其中包裝質粒提供了病毒基因組 m RNA 包裝成完整毒粒所必需的結構蛋白、聚合酶和包膜蛋白。
HIV-1是慢病毒中最具特徵性的病毒，第一個慢病毒載體系統即以其為基礎構建的。慢病毒載體的構建原理就是將HIV-1基因組中的順式作用元件和編碼反式作用蛋白的序列進行分離。為了降低兩種成分同源重組產生有複製能力的病毒的可能性，將包裝成分的5’LTR換成鉅細胞病毒(CMV)啟動子，3’LTR換成SV40 polyA位點等。將包裝成分分別構建在兩個質粒上，即一個表達gag和pol、另一個表達env。
實驗步驟
一、前期準備：
1)構建含有目的基因的病毒載體，抽提高濃度、高純度的包裝質粒和目的質粒;
2)指數生長的293T細胞(培養條件：DMEM+10%FBS, 37°，5%CO2)
3) 試劑：胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、lipo2000
4)儀器設備：熒光顯微鏡、、生物安全櫃、超速離心機
二、細胞分盤
轉染前一天，通過胰酶消化傳代於10cm 培養皿上，使細胞貼壁後所佔面積達到培養皿總面積的80%以上)。將細胞置於含5%CO2的37℃溫箱中孵育8-24h,當細胞貼壁完全後即可開始轉染。
三、轉染
1)轉染前 1h 換液(用10ml 完全培養基置換舊的培養基)。
2)製備包裝質粒和目的質粒與轉染試劑的混合物。
a.取無菌5ml EP管，加入1ml 無血清Opti-DMEM，加入8µg 目的質粒和16µg 病毒包裝質粒(psPAX2：pMD2.G=1:1)，充分混勻;
b.取無菌1.5ml EP管，加入1ml 無血清Opti-DMEM，將50µl轉染試劑溶於Opti-DMEM中，充分混勻，靜置5min;
c.將轉染試劑稀釋液滴加到質粒稀釋液中，邊滴加邊輕輕混勻後在室溫放置20分鐘，使DNA和轉染試劑充分結合形成穩定的轉染複合物。
3)取出培養皿，將配置好的DNA-轉染試劑混合物加入到培養皿中，輕輕混勻，做好標記，放回培養箱中。
4)6~8h後吸去培養基，用4ml PBS清洗一次後，加入8ml新鮮完全培養基培養。
四、收病毒
轉染後每隔24小時收集培養後的上清至50ml離心管，做好標記，並給細胞更換新鮮的完全培養基。最後一次收集病毒液後，將接觸過病毒的槍頭、離心管培養皿等物品用84消毒液浸泡後丟棄。
五、純化
1)初純化：將收集到的病毒上清液於3500rpm，離心10分鐘，棄去沉澱，並用0.45μl濾膜對離心後的上清液進行過濾;
2)將過濾好的病毒上清液分裝到超速離心管中，兩兩對應配平衡(相差不能超過0.01g);
3)30000rpm，4°離心2小時;
4)離心結束後，可觀察到離心管底一側壁上有白色的病毒沉澱，可在外側管壁上將白色沉澱用馬克筆圈出，即做上標記。在生物安全櫃中打開離心管，小心吸掉上清;
5)每管加入40~100μl PBS，小心地將病毒沉澱吹散重懸;
6)根據需要將病毒重懸液分裝，於-80°冰箱中保存。
六、慢病毒滴度的測定
1)取4µl病毒樣品，加到4µlDNase I酶反應體系中，將樣品於37°水浴1h左右後94°滅活DNase I;
3)稀釋標準品質粒設置標準品的拷貝數梯度為105、106、107、108、109 2)加入2µl蛋白酶K於55°水浴1h後94°滅活蛋白酶K，消化病毒表面的外殼蛋白，暴露出病毒的基因組RNA，備用; 拷貝數公式：拷貝數=摩爾數×6.02×1023 =質量÷分子量×6.02×1023
質粒分子量計算：此處可以用代碼實現，大家可以自行找相關小工具，將質粒全部鹼基輸入，選擇雙鏈、環狀，提交即可自動生成質粒的分子量，單位是“道爾頓Da”，即g/mol
4)配置qPCR反應體系，每個樣品和標準品設計3個復孔，qPCR反應體系如下：
qPCR反應程序如下：
6)計算待測樣品的滴度：將待測樣品的Ct均值帶入標準曲線的函數公式，計算所加入的病毒樣品模板拷貝數X，再換算成滴度。換算公式為：慢病毒滴度=10X×8(稀釋倍數)/µl5)製作標準曲線：以每組標準品的Ct均值為縱座標Y，其對應的拷貝數的對數為橫座標X，做標準曲線，得出標準曲線的函數公式及R平方值;
溫馨提醒：推薦——Biofavor慢病毒包裝服務
對於不少科研人員來說，慢病毒包裝實驗步驟複雜且實驗週期長，並且容易出各種問題，為了節省寶貴的時間建議大家選擇慢病毒包裝服務，巴菲爾生物的慢病毒系統屬於第三代慢病毒系統，生物安全性高，採用VSVG包膜，宿主範圍廣泛，慢病毒滴度高，其病毒滴度可以達到10^9TU/mL。
實驗流程
巴菲爾生物的慢病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP、NSE等多種啟動子可供選擇;而且還有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多種熒光標記蛋白可供選擇;抗生素篩選基因有Puromycin、Neomycin、Hygromycin等可供選擇。
你只需要提供相關基因信息(基因ID、名稱、序列等)，巴菲爾生物將提供完整的實驗流程報告、測序文件、實驗圖片、實驗數據等，還可提供慢病毒感染各類細胞及動物的相關實驗，很全面了有木有！
我們只能幫你到這裡了，剩下的就要看你自己了！
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