撰文 | Leon
目前，对新冠病毒SARS-CoV-2的临床检测（包括CDC推荐的方案）需要从患者样本中提取RNA进行RT-qPCR。这些RNA提取的步骤使整个检测过程复杂化，并且所需的检测试剂供应十分紧张。因此，许多实验室都在开发快速简便的检测方案。几天前，美国Broad Institute的张锋实验室发布了一个新的替代方案。该protocol只需要花5分钟的时间，不需要进行提取RNA的繁琐操作。此protocol与鼻咽拭子采样兼容，且不影响RT-qPCR敏感度。
注意：该protocol尚未被批准用于临床，也未在大量患者样本上进行过验证。
现在的主要检测手段是基于RT-qPCR的方法。其他的比如血清学的检测也在广泛应用，但是基于PCR的方法对于检测早期的感染者还是非常必要的。很多基于PCR的方法（还有基于等温扩增的方法）已经在临床上进行应用了（详情请查阅https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-use-authorizations#covid19ivd）。这些方法在检测之前都无一例外需要提取RNA。
由于提取试剂盒的缺乏和通量比较低，RNA的提取成为病毒检测的瓶颈。因此，张锋实验室开发了一个一步到位，不需要离心，5分钟内可以完成的方法。该方法可以直接跟CDC的RT-qPCR方案联合使用，提高检测通量和降低试剂供应链断裂造成的影响。
试剂：
· Lucigen的QuickExtract™ DNA Extraction Solution（QE09050，以下简称QE）融化后，分装储存于-20℃，避免反复冻融超过3次。
· 储存于病毒运输培养液（Viral Transport Medium）的鼻咽拭子。
步骤：
1. 用QE按照1：1稀释来自阳性患者或健康人的鼻咽拭子样本。比如在一个PCR管里面，混合20 μL的拭子样本和20 μL的QE。
2. 混合好后95℃孵育5分钟，进行下一步之前在冰上冷却。
3. 从qRT-PCR反应的第二步开始，加入量为10%的总体积。例如，如果反应的总体积是50 μL，使用5 μL。研究者测试了一系列的buffer，最后确定了QE。所有测试过的buffer里面，QE呈现的结果与标准的RNA提取试剂盒最接近。它能够高效地裂解病毒，并且保留RT-qPCR反应的活性（使用CDC推荐的TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix）。
为了确定QE没有影响RT-qPCR的活性，实验人员把合成的SARS-CoV-2基因片段（TwistSynthetic SARS-CoV-2 RNA Control 1，SKU：102019）溶解在dd水或dd水和QE 1：1混合的体系里进行了RT-qPCR。每个反应的总体积为10 μL（1 μL的RNA样本，0.5 μL的CDC探针N1，2.5 μL的TaqPath™RT-qPCR master mix，6μL的dd水）。在这些反应里，我们发现QE终浓度5%时没有降低RT-qPCR的灵敏度（图1A）。
实验者用4个COVID-19阳性的鼻咽拭子样本对这个方案进行了验证，发现QE和标准的RNA提取试剂QIAmp Viral RNA Miniprep (Qiagen)的灵敏度类似（图1B）。为了模拟低程度的病毒感染，在提取RNA之前，研究人员把病毒阳性的鼻咽拭子样本按照1：10稀释。用QIAmpViral RNA Miniprep提取时用了100 μL的拭子样本，最后用100 μL的dd水洗脱。每个10 μL的RT-qPCR反应中含有1μL的洗脱样本或1μL的QE提取样本。
图1.（A）对溶解于水或QE：水=1：1的SARS-CoV-2RNA进行RT-qPCR。最终反应体积为10μL里面含有1μL的样本。（B）稀释过的COVID-19阳性样本用QE在95℃孵育5分钟或用QIAmpViral RNA Miniprep提取RNA，然后进行RT-qPCR。
张锋实验室提出了一种不依赖于RNA提取试剂盒的样本提取方法，可以适用于基于RT-qPCR的COVID-19检测。对许多buffer进行测试后发现，这种用QE进行RNA提取的方法和FDA批准的RNA提取试剂盒的效果相似。但是，这种方法只在少量的临床样本上进行了验证，在真正应用于临床之前应该得到相关部门的审查和许可。
原文链接：https://zlab.bio/s/Ladha-et-al.pdf
閱讀更多 BioArt 的文章
