CRISPR-Cas酶对DNA的操纵需要识别原间隔子相邻基序（PAM），从而将靶位点识别限制在序列子集中。因此，
PAM基序阻止了CRISPR靶位点的准确定位，并且是基因组编辑应用的主要障碍。2020年3月26日，哈佛医学院Benjamin P. Kleinstiver团队在Science 在线发表题为“Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants”的研究论文，该研究设计了化脓链球菌Cas9（SpCas9）的变体，以消除NGG PAM的要求。
该研究开发了一种名为SpG的变体，能够针对一组扩展的NGN PAM，并进一步优化了该酶，以开发出一种近PAMless SpCas9变体，名为SpRY（NRN> NYN PAM）。SpRY核酸酶和碱基编辑器变体可以靶向几乎所有PAM，在人类细胞中具有NRN PAM的广泛位点上均表现出强大的活性，而对于具有NYN PAM的酶则具有较低但重要的活性。使用SpG和SpRY，该研究生成了以前无法获得的与疾病相关的遗传变异，从而可以在基因组任何序列进行编辑。
靶向DNA的CRISPR-Cas酶识别与外源DNA的靶位点相邻的短序列基序的要求是CRISPR系统区分自身与非自身的关键步骤。但是，对于基因组编辑应用，Cas9和Cas12a蛋白识别原间隔子基序（PAM）的必要性限制了靶向性并影响了编辑效率和灵活性。化脓性链球菌的原型Cas9（SpCas9）自然识别NGG PAM的靶位点，使其成为迄今为止表征最强的CRISPR酶之一。
能够靶向NGN PAM的SpCas9变体的工程设计和表征（图源自Science）
虽然其他自然存在的Cas直系同源物原则上可以通过识别不同的非规范PAM来扩大靶向，但绝大多数Cas9和Cas12a酶都需要扩展的基序，从而限制了它们在基因组编辑中的效用。因此，PAM基序阻止了CRISPR靶位点的准确定位，并且是基因组编辑应用的主要障碍。
改善基因组编辑技术靶向范围的一种方法是有针对性地设计可以靶向以前无法接近的PAM的CRISPR酶。SpCas9主要通过直接分子经由R1333和R1335的氨基酸侧链读出鸟嘌呤DNA碱基来识别其最佳NGG PAM。精氨酸单独修饰会减弱SpCas9核酸酶针对NGG，NAG或NGA PAM的位点的活性，这需要使用分子进化来通过PAM相互作用（PI）域中其他氨基酸的突变来改变PAM偏好。
能够靶向NRN PAM的SpCas9变体的工程设计和表征（图源自Science）
已经采取了几种蛋白质工程策略来扩展SpCas9的靶向性，包括使用定向进化或结构指导的工程开发改变的PAM变体（例如SpCas9-VQR，VRQR和VRER）或宽松的PAM偏好（例如SpCas9-NG和xCas9）。尽管这些变体扩大了SpCas9的潜在靶向空间，但编码大多数非经典PAM的靶位点仍无法进行基因组编辑。
SpG和SpRY扩展了C-to-T碱基编辑器的功能（图源自Science）
在这里，研究人员利用结构导向的工程技术几乎完全放松了SpCas9的PAM要求。这种方法能够生成具有高度酶促活性的NGN PAM变体（命名为SpG），随后对SpG的优化导致了能够编辑几乎所有PAM的变体（命名为SpRY）。该研究证明了SpG和SpRY可以提高编辑分辨率，并提供新的基因组编辑功能。更广泛地讲，该研究的分子策略原则上应可扩展至Cas直系同源物，从而为开发不受其固有靶向限制所束缚的编辑技术铺平了道路。
参考消息：
https://science.sciencemag.org/content/early/2020/03/25/science.aba8853?rss=1
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