最近天氣逐漸放晴，冬日的陰霾早已逐漸消散，雖然疫情還未過去，但我們正在有序的恢復往日的生活，作為科研工作者，大家的神經正在被國自然所牽動，如何尋求創新性？關注新技術不失為一種有效便捷的方法。還記得年前小編給大家推送的單細胞測序熱搜新榜——空間轉錄組測序技術，這項技術不僅新，而且已經商業化，商業化意味著你可以換個物種，換個組織部位，總之，換換換之後總會有一些新的發現。之前已經跟大家分享過原理啦，今天小編給大家分享一篇文章，看10x Genomics Visium空間轉錄組技術是如何應用在科研上的~
研究背景
研究表明，肌萎縮性脊髓側索硬化症（ALS，又名漸凍人症）的癱瘓是由運動神經元退化導致骨骼肌失神經所引起，但是驅動這些過程分子事件的時空順序尚不清楚。
本研究通過空間轉錄組技術分別獲得了包含正常和患病，4個時期（症狀前、發病、症狀期和終末期）的67只小鼠的腰椎脊髓組織切片樣本和7個人類散發性ALS患者的腰椎和頸脊髓組織切片樣本中的基因表達和空間位置信息，結合免疫熒光實驗和已發表scRNA-seq數據，描述ALS的潛在分子機制，並在臨床樣本中進行驗證。
實驗材料
包含正常（SOD1-WT）和患病（SOD1-G93A ），4個時期（症狀前、發病、症狀期和終末期）的67只小鼠的腰椎脊髓組織切片樣本和7例人腰大肌或球囊起病的散發性ALS患者屍檢腰椎和頸脊髓組織切片。
研究思路
主要研究結果
1. 小鼠脊髓基因表達的時空解析
對包含正常和患病的4個時期（症狀前、發病、症狀期和終末期）67只小鼠的1,200個左右腰椎脊髓組織（L3-L5）切片樣本和7個腰大肌或球囊起病的散發性ALS患者的80個屍檢腰椎和頸髓組織切片進行空間轉錄組（ST）測序分析，分別獲得了與小鼠相關的超過76,000個空間基因表達測量值（SGEMs）和與人相關的超過60,000個SGEMs。
利用11個解剖註釋區域（AAR）的標記對每個（SGEM）進行註釋，並使用這些標記進行差異表達分析。利用新的算法——層次生成概率模型來糾正由於採樣不足和偏差造成的數據丟失，進而可以準確估計基因表達水平，並檢測重要的區域、解剖學和細胞類型的變化。最後分析得到了小鼠的11,138個基因和人的9,624個基因的空間分佈。
此外，對完整的小鼠SGEM數據集的PCA表明，大部分方差是由空間位置、疾病狀態和基因型解釋的，而不是由批量效應解釋的。此分析揭示了幾個已知的ALS基因（如Matr3、Kif5a和Pfn1），同時涵蓋了與已描述過的區域表達譜和在ALS進展中起作用相關基因的時序表達模式和所在的特定區域，這一點經過免疫熒光實驗（IF）的驗證。此外，分析結果表明在ALS中小膠質細胞功能障礙發生在症狀開始之前，早於星形膠質細胞功能障礙，並且是接近運動神經元的。
圖1 小鼠脊髓內基因表達的時空解析
2. 症狀前TREM2和TYROBP介導的信號失調
為了進一步探索小膠質細胞激活的時空動力學，作者重點研究了在神經退行性疾病模型中已被報道的TREM2相關機制。TREM2和TYROBP形成一種受體複合物，當與膜脂或脂蛋白複合物結合時，可以觸發吞噬作用或調節細胞因子信號。空間基因表達分析表明TREM2介導的機制在ALS小鼠模型中具有時空順序。
圖2 症狀前TREM2-和TYROBP-介導的信號失調
3. ALS疾病進展過程中基因表達的時空動態
為了更好地理解疾病相關的基因調控變化和細胞類型之間的相互作用，對ST數據進行共表達分析，鑑定了31個主要共表達模塊，它們具有不同的時空和通路活性，其中一個子集在Atg7 cKO中受到影響。並結合已發表的scRNA-seq數據確定了區域星形細胞群的基因表達程序特徵，它們表現出明顯的、與疾病相關的時空動態，並在不同程度上依賴於膽鹼能自噬。同時，這也允許去識別反映疾病主要方面的跨細胞類型的協調活動，並突出與這些過程相關的不同細胞類型中的表達程序。其中模塊8所包含的通路活動揭示了完整組織中神經膠質早期激活過程中細胞內和細胞間的信號通路，以及ALS小鼠模型中維持和擴展反應性表型的機制。而模塊1中小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞表達程序的時空相關性揭示了在ALS動物中晚期軸突病理相關的膠質行為中信號機制的協調。
圖3 ALS疾病進展過程中基因表達的時空動態
4. ALS患者死後脊髓組織中鞘磷脂信號通路
將ST流程應用於4例臨床表現為延髓症狀的ALS患者和3例出現下肢症狀的ALS患者的頸椎和腰椎組織。他們表現出預期的區域表達模式，類似於本實驗的小鼠數據集。與已報道的研究結果一致，本研究也發現ALS病理的嚴重程度與症狀部位的鄰近程度有關，在人數據集中顯示腹角的基因表達與這種鄰近程度有關。例如，編碼乙酰膽鹼酯酶（ACHE）的基因，其活性與ALS中的神經肌肉缺陷有關，並在支配症狀發作部位的脊髓節段近端表達減少。人的ST數據同樣也做了共表達分析，得到28個表達模塊，其中一些在小鼠中也存在。共表達結果表現出AAR特徵模式，其中一些模式沿延喙尾軸變化，或在白質和灰質之間存在差異，或接近症狀發作部位，此外，人的表達模塊3在症狀出現的近端脊髓節段減弱，且這種衰減在後白質和腹角最為明顯。KEGG分析顯示，人的表達模塊3被富集到幾個通路，包括鞘脂類、逆行內源性大麻素和wnt信號，同樣地，顯示疾病相關動力學的人和小鼠子模塊也被富集到鞘磷脂信號通路，這表明了在ALS病理學中此機制的重要性。事實上，在ALS患者的脊髓和SOD1 ALS小鼠模型中均有糖磷脂水平及其代謝改變的相關報道。在ALS的小鼠模型中，神經鞘磷脂信號轉導物質被認為是一種潛在的治療方法。本實驗詳細描述了多種細胞類型、脊髓區域和疾病分期中鞘磷脂信號的動態變化，這為調節該通路活性的潛在治療策略提供了見解。
圖4 ALS患者死後脊髓組織的時空轉錄組
總 結
本文利用10x Genomics Visium空間轉錄組技術獲得疾病過程中小鼠脊髓和肌萎縮性脊髓側索硬化症患者死後組織的基因表達量，並結合一種新算法識別通路動力學，在早期區分小膠質細胞和星形膠質細胞群的區域差異，並識別小鼠ALS模型和患者死後脊髓之間共存的幾個轉錄通路的擾動，描述ALS的潛在分子機制，並在臨床上進行驗證。
安諾單細胞測序技術總覽
作為國內單細胞測序技術整體解決方案的提供商，目前安諾基因單細胞多組學研究具有全面的產品，覆蓋三大組學（基因組、轉錄組、表觀組），擁有豐富的項目經驗、
合作單位100+、物種經驗50+、多篇高分文章IF累計200+，能夠有針對性並準確服務於不同的研究領域及研究策略，使得科研工作者可以更深入地瞭解細胞間的異質性。參考文獻：
Maniatis S, Äijö, Tarmo, Vickovic S, et al. Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophic lateral sclerosis[J]. Science, 2019, 364(6435):89-93.
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