Western blots是學術不端裡面最常見被“放大鏡”觀察的一個地方，作為科學研究裡的一種簡單而又“不簡單”的技術，Elisabeth Bik教授做了詳細的講解。
近來，Elisabeth Bik團隊曝出的400篇涉嫌造假論文，裡面主要線索就是Western blots的圖像（參見： ）。
科學論文中的許多圖像問題（複製、操作）都是在Western blots中發現的。Western Blots是研究蛋白質的標準實驗室技術，蛋白質是所有生物體的三個基本組成部分之一（另外兩個是DNA和RNA。）
這三種方法中，第一種被密切調查的是DNA，使用的是英國分子生物學家Edwin Southern於1975年發明的一種方法，因此被稱為“Southern Blotting”。
在這種只有科學家才會想到的笑話中，後來為RNA和蛋白質開發的分析工具相應地被命名為“Northern Blotting”和“Western Blotting”。
（純粹主義者可能會注意到，由於只有三個組成部分，所以沒有“Eastern Blotting”。）
DNA–RNA–蛋白質
所有生物體（植物、動物、細菌等）中的三種基本分子類型是：
DNA：一種雙鏈、螺旋形的非常長的分子，儲存遺傳信息。這些長長的DNA鏈一起形成了一個有機體的基因組。
RNA：一種單股螺旋狀分子。它的形狀和信息與DNA相同，但它是由不同的分子組成的。它作為一種短命的、暫時的信使分子，可以複製儲存在DNA中的一部分信息，作為構建新蛋白質的藍圖。
蛋白質：一種球狀、摺疊的氨基酸鏈，是細胞或酶的結構部分，能進行化學反應，製造或分解其他分子，如多糖或脂類。
這幅偉大的漫畫摘自Jaclyn Taroni在兒童癌症數據實驗室博客上的一篇文章，DNA就像一本食譜豐富的烹飪書，RNA是一個單一的食譜，蛋白質是菜餚（還有紙杯蛋糕！）它們是按照配方製備的，而細胞和組織則由許多這些準備好的盤子組成。
(Source: Jaclyn Taroni – Childhood Cancer Data lab.
Found at: https://www.ccdatalab.org/blog/2019/7/1/how-does-big-data-help-us-tackle-childhood-cancer)
研究蛋白質
研究蛋白質的生物學家有時想知道蛋白質有多大，在特定的細胞類型或組織中發現了多少蛋白質，或者細胞中某些蛋白質的數量是如何隨著藥物治療或疾病的反應而變化的。為了瞭解這些，他們可以使用一種叫做Western blot的分子技術。
第一步：蛋白質凝膠電泳
在研究人員進行Western blotting之前，蛋白質需要在SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）過程中分離。在這項技術中，蛋白質樣本在一種叫做“凝膠”的類似果凍的物質中按長度分離。這個過程有幾個步驟：
1.首先，將細胞或組織均勻化並進行預處理，使每個樣品由不同蛋白質的液體混合物組成。
2.蛋白質混合物與肥皂狀的清潔劑溶液SDS混合，使其展開和拉伸，並用負電荷覆蓋。
3.蛋白質/洗滌劑混合物裝在“凝膠”的頂部，這是一層薄薄的（約1毫米）類似於果凍的物質，稱為聚丙烯酰胺，倒在兩個玻璃板之間。多個蛋白質混合物可以在凝膠頂部被稱為“槽”的小孔中相鄰裝載（見下圖）。
4.施加電流，正極位於凝膠底部。結果，所有帶負電的蛋白質都想移動到凝膠的底部。樣品從凝膠的頂部緩慢地移動到底部，每個樣品在一個單獨的“通道”中，就像運動員在跑道上跑步一樣。
5.然而，這種凝膠材料類似於一片茂密的叢林，使得蛋白質很難跑到底部的正極。長蛋白質比小蛋白質在叢林中生存的時間要長。因此，在施加電荷一段特定時間後，小蛋白質比大蛋白質移動得更接近底部，因此移動得更慢。這樣蛋白質的複雜混合物就可以按長度分離。
6.當最小的蛋白質到達凝膠的底部時，電極被移除，用來固定凝膠的玻璃板被相互剝離。
7.凝膠現在可以染色以顯示所有蛋白質（例如，用考馬斯亮藍或胭脂紅染料），或者凝膠可以通過Western blotting檢測一種或幾種蛋白質。
(Separating proteins in an SDS PAGE gel by length.
Source: http://infoupdate.org/sds-page-gel-recipe/)
蛋白印跡法
在Western blotting過程中，分離的蛋白質被轉移到膜上，然後與特定抗體一起孵育，以研究均質樣品中許多蛋白質混合物中的一種或幾種蛋白質。這種膜比含有蛋白質的果凍狀凝膠要堅固得多，這種凝膠很容易破裂或撕裂。
1.首先，將含有蛋白質的凝膠放在一個薄膜上，薄膜看起來像一張小紙片。這種膜由硝化纖維或聚偏氟乙烯（PVDF）製成，蛋白質很容易與之結合。
2.凝膠中的蛋白質通過“印跡”轉移到膜上。有幾種方法可以做到這一點，要麼在堆積的凝膠/膜上加一個砝碼，等待蛋白質與膜結合，要麼施加電流。
3.這種膜，現在被稱為“印跡”，與一種針對特定蛋白質的抗體一起孵育。假設你想研究一種叫做EGF的蛋白質的含量。因此，你可以用一種抗EGF的抗體來孵化這個印跡，這種抗體被稱為“抗EGF”。
4.抗體將結合在EGF位於印跡上的位置。如果是一個小蛋白，EGF將位於印跡的底部。
5.用抗體孵育印跡後，沖洗膜，以洗去任何未結合的抗體。
6.然後用與第一種抗體結合的第二抗體孵育膜，以放大信號。這種二級抗體具有放射性或化學發光基團，使其在X射線膠片、感光膠片或數字掃描儀上可見。
7.該膜現在將在最初感興趣的蛋白質（如EGF）的位置包含窄的水平條紋。通常，每條通道都有一條水平條紋。我們稱這些條紋為“條帶”。
(Western Blotting.
Source: https://www.mybiosource.com/learn/westernblotting)
凝膠、斑點、通道和帶
在蛋白質凝膠中，樣品中的所有蛋白質都是按長度分離的。在下面的圖片中，你看到一種凝膠，左邊有6個“通道”。 通道1由一種人工的，商業上可買到的10種不同大小的已知蛋白質的混合物組成，稱為“標記物”。通道2-6由數千種不同大小的蛋白質組成的複雜樣品混合物組成。凝膠用一種與所有蛋白質結合的青色染料處理。
在右邊，你可以看到左邊的凝膠的複製品，一個已經轉移到膜上，然後用一種特殊的抗體，即針對一種叫做CDK7的蛋白質進行孵化。儘管2-6通道中存在1000種不同的蛋白質，但只有CDK7蛋白帶可見（有幾個“訣竅”使標記帶可見）。因此，儘管CDK7蛋白在1000種其他蛋白的混合物中幾乎看不到，Western blot技術允許我們以高精度和高靈敏度研究它。
Western blot條帶的厚度/強度是對特定樣本中蛋白質含量的測量。凝膠中的位置（靠近印跡的頂部或底部）是衡量蛋白質大小的指標。由於標記蛋白（在第1道）的大小是已知的，我們可以估計未知蛋白的大小。
負載控制蛋白
Western blot可以去除抗體，然後與不同的抗體重新孵育以研究不同的感興趣蛋白。這個過程可以重複幾次。
為了確保所有通道都裝載了相同數量的總蛋白，並且為了獲得感興趣蛋白質數量的分母，其中一個重複的westernblot可能涉及查看裝載控制蛋白。這是一種蛋白質，在一種細胞或組織類型中，它的含量總是相同的，與實驗無關。
典型的控制蛋白是β-肌動蛋白、GAPDH、AKT或α-微管蛋白。這些是真核細胞功能所必需的“家庭”蛋白質。通常情況下，負荷控制培養顯示在圖的底部，帶有多個Western blot面板。
在下面的圖片中，你可以看到4種蛋白質（A-D）的數量在不同的實驗（1-8）之間變化，而微管蛋白（底部面板）的數量保持相當恆定。
每個條帶都應該是獨一無二的
正如你在上一段中看到的那樣，Western blot條帶的形狀和間距是非常可變的。條帶的形狀可以像煎餅、啞鈴、魚、蠕蟲、木屐、蝴蝶結、W、M、微笑的嘴，或者你在裡面看到的任何東西。形狀取決於研究人員如何將樣本裝載到凝膠上，蛋白質的數量，以及凝膠裝置的特性。然後你可能會注意到凝膠帶和背景中的斑點、汙漬、斑點、劃痕、氣泡和其他不規則現象。所有這些變化導致條帶看起來都有點不同。就像岩石，樹葉，臉一樣，每一個條帶都是獨一無二的。當然，這完全取決於印跡照片的分辨率和曝光度。
因為Western blot條帶應該是唯一的，所以人們可以通過視覺檢查blot照片並檢測出看起來比預期更相似的條帶——這可能暗示著重複或操作。
在下圖中，你能在面板A和D中檢測到一些看起來比預期更相似的波段嗎？
(Four Western Blot panels, each representing a different protein (A through D) in 5 different E. aerogenes strains (1-5). Can you detect some bands that look more similar than expected in panels A and D?)
為什麼叫Western blotting？
“Western”blot這個名字來源於1975年Edwin Southern開發的一種古老的技術，叫做“Southern blotting”。在Southern雜交中，DNA被轉移到膜上，並用探針進行檢測。兩年後的1977年，一種類似的檢測RNA的技術被稱為“Northern”印跡法，這有點像一個笑話，但這個名字一直沿用至今。1979年前後，當三個不同的實驗室開發出一種類似的技術來轉移和檢測特定的蛋白質時，“Western”印跡法似乎是一個明顯的名字。既然生命只有三個基本分子，就沒有“Eastern blotting”！
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