RNA-XPress™ 快速提取試劑
RNA-XPress™ Reagent
簡介
RNA-XPress為即用型，用於從各種樣品中快速分離RNA。獲得的RNA可用於下游的Northern Blot、mRNA分離、體外翻譯、RT-PCR、核酶保護實驗等
原理
RNA-Xpress為硫氰酸胍和苯酚的單相混合液，能有效溶解RNA。加入氯仿並離心後，溶液分為3相，水相含RNA，中間相含DNA，有機相含蛋白質。1ml RNA-Xpress可用於50-100 mg組織、5-10×10 6細胞、或10 cm2平皿單細胞層。該方法對Chomczynski和Sacchi發明的RNA一步分離法進行了改進，可在1小時內完成。
樣本類型
人、動物、植物、細菌、酵母、病毒
操作流程
A) 樣本製備
1a. 組織：採用勻漿器將樣品和RNA-Xpress試劑充分混勻， 1ml RNA-Xpress試劑適合50-100mg組織
1b. 單細胞層: 在平皿中直接裂解細胞，10 cm2平皿單細胞層加1mlRNA-Xpress，用移液器吹打。平皿要求為玻璃皿，不能為塑料皿。
1c. 懸浮細胞：最多離心1×107細胞，4℃，300 × g，5min。棄上清，加1mlRNA-Xpress試劑，反覆吹打。（動物細胞、細菌、酵母、植物細胞數量均同上）
注意：
1. 細胞用RNA-Xpress勻漿或裂解後，在-70℃最多放1個月時間。
2. 如果下列成分含量較高，可能需要額外的操作步驟，具體參考原版說明書：脂肪、蛋白、多糖和細胞外基質（如肌肉）。
B）相分離
將均質化的樣品在室溫（15-25℃）孵育5分鐘，使核蛋白複合物完全解離。
每毫升RNA-Xpress試劑加入200μl氯仿。蓋緊樣品，劇烈搖動15秒，在室溫（15-25℃）下靜置10分鐘。將得到的混合液以12,000×g（≈13,000rpm）在4°C時離心15分鐘。離心後，混合液分成底部深紅色有機相（含蛋白質），中間相（含DNA）和無色含有RNA的上層水相。
注意：
用於相分離的氯仿不應含有異戊醇和其他添加劑。
C）RNA沉澱
將含有RNA的水相轉移到新管中並加入500μl異丙醇。讓樣品在室溫（15-25℃）下靜置5-10分鐘。 在4℃下 以12,000×g（≈13,000rpm）離心10分鐘。通常在離心前不可見的RNA沉澱，在管底或側面形成膠質狀沉澱。
D）RNA清洗
去除上清液而勿碰到沉澱。加入1ml（至少）75％乙醇清洗RNA沉澱。渦旋樣品，然後在4℃下以 7500 x g（≈10,500rpm）離心5分鐘
E）RNA復溶
去除上清液而勿碰到沉澱。風乾RNA沉澱5-10min。不要讓RNA完全乾燥。加50µl無RNA酶水溶解RNA。為方便溶解，可用移液器反覆吹打。在55-60°C孵育10-15分鐘。提取的RNA可在-80°C保存。避免反覆凍融。
RNA濃度、產率和純度
製備的RNA不含DNA和蛋白質。RNA可測260nm、280nm、320nm吸光度。OD260應在0.1~1.0，OD320用於背景校正。OD260=1對應約40µg/ml RNA。純度=OD260/ODA 280，應≥1.7。
組織的RNA產率（µg RNA/mg 組織）：肝臟、脾臟（4-10 µg）、腎臟 (2-4µg)、骨骼肌、大腦 （1-1.5 µg）、胎盤（1-4µg）
培養細胞的RNA產率：上皮細胞(6-15 µg)、成纖維細胞(3-7 µg)
存儲條件
15--25°C
參考文獻
1. Chomczynski P., BioTechniques 15, 532-537(1993).
2. Chomczynski P. and Sacchi,N., Anal .Biochem.,162,156-159(1987).
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