非洲猪瘟早期诊断原理与技术
摘要
非洲猪瘟（ASF）的防控是目前我国养猪业面临的一大难题，困扰着众多从业者。为了加强防控，本文从ASF早期诊断的重要性、早期诊断的原理、唾液样本的采集、早期检测方法等方面总结了国内外众多学者、生产管理者的实践经验，以供参考。
我国自2018年8月初报告发生ASF，然后在5个月内迅速传遍全国，造成巨大经济损失。由于ASF无疫苗可用和无药可治，因此防控面临困难。实际生产中，从业者摸索出一些实战经验，如早期诊断、早处置、唾液检测等方法。本文在总结众人的研究与实践结果基础上，做一综述。
1 早期诊断的重要性
早期诊断的目的是为了及时发现感染猪，并及时扑灭传染源。传染病的发生必需具备3个环节，即传染源、传播途径、易感动物，控制任一环节即能控制传染病的发生。对于ASF来说传播途径多，具体到某个猪场，到底是如何传入的，仍然只是猜测，没有一个场有明确的证据，因此为了切断所有可能的传播途径，养殖场付出了巨大的人力、物力、财力代价；由于没有疫苗可用，因此从保护易感动物角度来说也不具有可操作性。故此，消灭传染源成了当前防控ASF的主要措施之一，这就需要按照国家有关法律法规早发现、早诊断、早处置。
2 早期诊断的原理
为什么要做早期诊断呢？因为猪感染早期不排毒或排毒少（表1），配合好无害化处理、消毒等措施，不易造成扩大传播。发病猪后期血液中含有大量病毒，病毒滴度可以达108HAD50/mL，而1-10 HAD50的病毒就可感染1头猪，所以每毫升血液理论上可以感染1000万头以上的猪。如果用100吨水来冲冼1mL这样的血液，那么这100吨水中的1mL水仍可感染一头猪，因此运猪车辆的消毒现在弄得比较复杂也是这个道理。所以早期诊断就是要在猪排毒之前发现感染猪，及时扑灭传染源。如果猪舍有病猪存在，甚至在猪场剖检病猪，其病毒污染量将是个天量，疫情扩散压力极大。同时也表明对病猪进行治疗也是非常不合适的，可能救活了一头猪，但感染了一群猪。
当ASF病毒进入养殖场，并感染猪后，首先在感染局部如扁桃体定位增殖，这时并不具有传染性；
表1 猪感染ASF病毒后时间与临床表现、散毒、排毒量关系
当病毒繁殖到一定量后，侵入血液并到达肺等部位大量增殖，这时猪只可通过排泄器官排毒，传染性逐渐增强。Claire Guinat等研究发现，同群猪只之间自然接触感染猪的潜伏期7-10天，平均9.9天，比人工肌注感染猪的潜伏期长3-6天（平均4.4天）。因此，有足够的时间来检测发现潜伏阶段的猪，这就为早诊断提供了理论基础。步志高团队研究了中国流行毒株在猪只间自然接触感染情况下，第6天口腔拭子可检出，第9天血液中可检出阳性，因此有3天的窗口期供早诊断。从病原检出部位来看，最早可检出的是扁桃体，然后是口鼻拭子，其次是肛门拭子，最后是血液。病毒从扁桃体进入血液，猪就开始具有了传染性。因此最理想的检测样本是扁桃体，其次是口鼻拭子，但考虑到采样的方便性，临床用得最多的是口鼻拭子或唾液。
3 唾液样本的采集
3.1 唾液的成分
唾液中含有各种复杂的成分，主要有分泌性抗体、各种有益或有害微生物、酶、激素、药物等。很多成分会影响到PCR的正常反应。
3.2 唾液样本的优缺点与改进措施
优点是与厌食同步，早于血液；无应激，易于大栏采集。适用于阴性猪场以七天为节律的监测，引种后的猪群连续14天的监测。缺点是病毒载量较低，样本易被核酸酶降解；采样需避开进食，阳性场可加速传播。改进措施是使用唾液保存液，用冰盒冷冻样本，猪场配备检测仪，迅速处理检测样本。
3.3 唾液采集的风险因素
病毒载量低，对检测方法的灵敏度要求较高；唾液中含有DNA酶和蛋白酶，可降解核酸；进食前后蛋白酶和DNA 酶的含量显著增加；不及时冷冻或运输中解冻，核酸均可被降解；在阳性场大群采集唾液时容易造成交叉感染，唾液棉绳不适用于发病场监测。相对而言，鼻腔粘液受到的干扰因素较小，采样时可同时采口腔拭子和鼻拭子，分开保存，使用时合并。
3.4 唾液大群采集程序
（1）固定取样绳：在栏舍内悬着一个位置固定取样绳，要保证栏内所有猪均可接触到取样绳。固定位置应该干净，远离饮水和进食区。取样绳低端应与猪站立时嘴的高度相平。如果同栏内分配多个取样绳，它们的位置尽可能的分开。宜在进食前两小时或进食后两个小时后进行采样。
（2）取样绳放置时间为30分钟。如果发现采样对象对取样绳不够活跃，可延长至1小时。
（3）小心取下取样绳，注意不要接触到地面。将取样绳内的唾液挤至无菌自封袋内。
（4）将上述自封袋剪开一个小口，将里面的唾液转移至准备好的无菌试管内。每个样品至少需要2ml。
（5）收集后，如果发现试管内有明显杂质，如饲料等，则需用离心机对样品进行纯化。离心机转速为2000转/分钟，离心1分钟。
（6）所取得的样本迅速放入冰盒中，或加入核酸保护液储存。
（7）在试管上标明取样栏舍、取样猪场、取样日期。
（8）采样时操作尽量快，需速冻，操作时间不能超过2h。
（9）所取得的样本迅速放入冰盒中，或加入核酸保护液储存。
（10）注意事项：采样时需带双层手套，每采一栏需更换外层PE手套；唾液运输过程中需保持冷冻状态；实验室检测时也要注意化冻后速检。
3.5 鼻腔或唾液拭子的采集方法
（1）操作者需佩戴乳胶手套后再佩戴一次性PE手套。
（2）选用长度大于10cm的长棉签，建议三根棉签同时采集鼻腔液或口腔液。
（3）棉签深入鼻腔或口腔至少8cm以上，搅动三圈，当棉签完全润湿后取出。
（4）将采集后的棉签放入自封袋中，准确标号（采样时间，样本原始编号，样品类型）。
（5）应做好原始记录；也可将棉签折断，将棉头部分放入EP管中。
（6）采集下一头猪时需更换PE手套。
（7）将采集后的样本放入冰盒中，样本需冷冻保存和运输。
3.6 血液和脏器散毒的风险极高，不适宜早期诊断
所有发病死亡猪体内均可检测到高水平ASFV载量，发病后期血液病毒滴度可达108 HAD50/ml以上，病死猪脾脏、淋巴结、肝、肾等器官组织病毒滴度介于105-108 HAD50/ml。依据测定Pig/HLJ/18毒株对猪半数致死剂量（PLD50）结果，病死猪每毫升血液所含PLD50病毒量达100万以上，每克组织所含PLD50病毒量达10万以上。非洲猪瘟感染猪凝血性差，静脉采血容易血流不止，散播风险极大。
4 早期检测方法
ASF病毒检测方法有经细胞吸附试验、双抗体夹心ELISA、胶体金试纸、荧光定量PCR、普通PCR、LAMP方法、热对流PCR等方法。目前最适宜和应用最广的荧光定量PCR方法。
4.1 荧光定量PCR方法的优缺点
荧光定量PCR是OIE推荐的ASF的检测方法。机器判读, 误差概率低，敏感性是普通PCR的100倍; 特异性高, 极少因方法的原因，出现假阳性; 含量可做为决策的依据，可在不同时间和不同空间上进行数据间的比较；操作环境要求低，可在实验室、野外进行核酸检测。缺点是需要仪器设备。
4.2 如何避免假阳性
荧光定量PCR在实际应用过程中出现假阳性的因素主要有3个方面。一是采样不当，原因是采样过程中导致的交叉污染，防范措施是加强采样规范。二是操作不当，原因是操作过程中样品间交叉污染，防范措施是多练习总结，熟能生巧。三是PCR产物污染，原因是上一次PCR产物形成的污染，防范措施是PCR管绝对不能开盖，甚至电泳，还有添加UNG酶。
4.3 如何避免假阴性
假阴性出现的原因主要表现在4个方面。一是操作不当，原因是核酸提取或试剂应用不到位，设置阴阳对照，可发现问题。二是试剂失效，主要是保存不当造成，设置阴阳对照，可发现问题。三是设备因素，主要是设备孔间差，收集不到信号呈现假阴性结果，很难被发现，可通过换不同设备对照检测发现问题。四是样本因素，样本中含有导致PCR效率降低或完全被抑制的成分呈现假阴性结果，很难被发现，可结合猪临床表现、流行病学分析及时发现问题。
5 后记
ASF的早期诊断是一个复杂的过程，综合了多种学科的技术，因此对管理、生产、技术人员的要求大大提高。显然这个技术不适用于中小规模猪场，而我国中小规模猪场数量庞大，它们的成败决定了ASF在我是是否能控制住的问题。所以防控ASF的任务仍然任重道远。
致谢：在此感谢相关的科研人员、生产一线人员的贡献。
广东省农业科学院动物卫生研究所研究员、博士，广东省生猪产业体系疫病防控岗位专家，主要从事动物传染病的研究与临床防控。主持和参加了各级各类科研课题近50多项，获得省部级科技成果奖8项，授权专利2项，参与制定国家、省部级标准并实施3项。主编专著4部，参编专著6部。发表研究论文50 余篇。
来源：《猪业》专题策划【防非增产行动】系列文章
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